X-ray Computed Tomography as a method of cryoprotectant concentration measurement and ice detection: application to organ cryopreservation.

Abstract

La criopreservación persigue la conservación de sistemas biológicos, como células, tejidos o pequeños organismos, a bajas temperaturas. Existen distintos procedimientos para llevar las muestras biológicas a temperaturas criogénicas, evitando la formación del principal causante de la muerte celular en estos procesos, el hielo. En 1949 se descubre la propiedad protectora de unas sustancias llamadas crioprotectores [1], normalmente alcoholes o azúcares, que previenen la formación de hielo y protegen la muestra a preservar, disminuyendo el punto eutéctico del sistema. Un control de su concentración es necesario debido a que pueden ser tóxicos. Uno de los principales retos de la criopreservación es la conservación de órganos. La criopreservación de células y algunos tejidos simples se lleva a cabo mediante procedimientos tradicionales conocidos como slow freezing, cuyo principio reside en la formación de hielo en el medio extracelular, provocando una deshidratación en las células y por consiguiente un descenso crioscópico. En el caso de órganos y sistemas más complejos dichos procedimientos no son aplicables, debido principalmente a la falta de un medio extracelular donde pueda formarse hielo y al gran volumen de la muestra, donde la transferencia de calor es más lenta. Es por esto que es necesaria la búsqueda de otros mecanismos de enfriamiento para su criopreservación [2]. A día de hoy se sabe que una alternativa posible es la vitrificación [3], proceso consistente en el paso de fase líquida a una fase sólida amorfa, evitando así la formación del hielo y su daño celular. Conseguir este estado sólido no cristalino requiere un control riguroso de la concentración del crioprotector y la temperatura de la muestra. En 2007, el grupo de Pegg [5] consigue desarrollar una técnica para criopreservar cartílago, y en 2009, Fahy et al. [6] muestran los primeros resultados de un riñón de conejo vitrificado con éxito demostrando un buen funcionamiento durante un largo tiempo tras su trasplante. Mientras que la temperatura es un parámetro fácil de monitorizar en los procesos de criopreservación, por ejemplo mediante el uso de termopares, la concentración de crioprotector es más difícil de controlar, especialmente en tejidos y órganos voluminosos. Esta tesis propone un método de medida de concentraciones de un crioprotector en particular, dimetil sulfóxido, mediante el uso de tomografía axial computarizada con una resolución de hasta 50 μm. Gracias a la colaboración del Centro Nacional de Aceleradores, dispusimos de un NanoCT cuyas bajas energías de rayos X consiguen medir la atenuación de rayos X en función la concentración de dimetilsulfóxido debido principalmente al átomo de azufre que constituye la molécula. Los resultados muestran una atenuación de los rayos X proporcional a la concentración de dimetil sulfóxido, en soluciones de volúmenes desde 200 μl hasta 20 ml. Los resultados muestran que el dimetil sulfóxido es detectable no sólo a temperatura ambiente sino también a temperaturas criogénicas, por debajo de los -130 oC. Además se prueba que las distintas soluciones son también medibles en tejidos, probado con riñones de conejos. Otra aplicación importante de la técnica del TAC es la detección de cristales de hielo en muestras biológicas, bien sea en muestras ya vitrificadas o durante el proceso de criopreservación y recuperación de las muestras. Las imágenes obtenidas en nuestras medidas muestran la detección de cristales de hielo de hasta 1 μl en riñones de conejos a bajas temperaturas, los cuales han sido previamente equilibrados con una concentración adecuada de dimetil sulfóxido. Esto permite, por una parte, poder evaluar daños producidos en las muestras ya vitrificadas, o bien ajustar los parámetros necesarios en los procesos de criopreservación de muestras biológicas, evitando en todo momento la formación de hielo. Por otra parte, en esta tesis se ha desarrollado un sistema para criopreservación de material biológico de mayor volumen, implementando técnicas de vitrificación por equilibrio consistente en el control de la concentración de crioprotectora y temperatura de la muestra. Para el enfriamiento de las muestras y el control de la temperatura se ha diseñado un método de enfriamiento adaptado a las características del aparato del TAC, que permite enfriar las muestras a temperaturas por debajo de -130 oC, además de controlar la temperatura en los procesos de enfriamiento y calentamiento, pudiendo obtenerse las velocidades de enfriamiento y calentamiento necesarias.