Estudio de electrodos modificados con películas de las bases del adn y nucleolípidos derivados mediante la combinación de métodos electroquímicos y espectroscópicos

Abstract

En esta tesis se han estudiado las adsorciones y co-adsorciones de las bases complementarias del ADN, así como las interacciones entre ellas, en las interfases organizadas de electrodos monocristalinos de oro o de películas de oro nanoestructuradas. Se ha utilizado para ello una metodología que combina técnicas de tipo puramente electroquímico, tales como los de voltametría cíclica, coulombimetría y espectroscopia electroquímica de impedancias (EIS, por sus siglas en inglés) con diversas técnicas espectro-electroquímicas por transformada de Fourier en el infrarrojo (FT-IR) “in-situ” . En concreto, se han utilizado las técnicas de absorción-reflexión en el infrarrojo en las configuraciones de reflexión externa (SNIFTIRS, por sus siglas en inglés) y (PM-IRRAS, por sus siglas en inglés) e interna (ATR-SEIRAS, por siglas en inglés), utilizando las correspondientes células espectro-electroquímicas que permiten la aplicación y variación de potenciales eléctricos a los electrodos de oro, de manera simultánea al experimento FT-IR. Los estudios de adsorción de las bases del ADN sobre electrodos metálicos son interesantes debido a la relevancia biológica de las mismas y las analogías de sus organizaciones en las interfases electródicas con las organizaciones en las membranas biológicas. Las técnicas que se han utilizado proporcionan una información estructural a escala microscópica interesante en función del campo eléctrico en las interfases. Por otra parte, los estudios tienen interés aplicado en relación con el diseño de biosensores o de plataformas de liberación de medicamentos. Los sistemas a estudiar se han seleccionado con dos grados de aproximación a las interfases biológicas. Así, en la primera parte (parte I de la tesis) se han estudiado las adsorciones de las cuatro bases del ADN y las co-adsorciones de los dos pares de bases complementarias sobre electrodos monocristalinos y sobre películas nanoestructuradas de oro en función del potencial. En la segunda parte (parte II), se ha realizado una aproximación mayor a las interfaces biológicas mediante el estudio de monocapas y bicapas de compuestos que contienen tanto cadenas alifáticas como alguna de las bases del ADN. En concreto, se han preparado estructuras organizadas del nucleolípido 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-citidina, que contiene la base citosina, sobre electrodos Au(111). Se han caracterizado dichas estructuras y se han estudiado sus posibilidades de reconocimiento molecular en relación con la base complementaria guanina. La tesis se ha estructurado en 7 capítulo. El capítulo 1 consiste en una introducción general de la tesis que contiene los objetivo, los antecedentes acerca de de la adsorciones y co-adsorciones de las bases del ADN, de sus propiedades ácido bases y de los equilibrios tautoméricos en los que participan. Incluye también la descripción de la estructura de la tesis. El capítulo 2 está dedicado a la metodología utilizada en la tesis y en él se describen los fundamentos teóricos y técnicos de las metodologías electroquímicas y espectro-electroquímicas FT-IR. En el capítulo 3 se presentan los estudios de las adsorciones y co-adsorciones de las bases complementarias adenina y timina. El grupo de investigación realizó previamente el estudio de la adsorción de la adenina en algunas condiciones experimentales, pero en esta tesis se han extendido los estudios acerca de los equilibrios ácido-base, mediante el estudio de las adsorciones de las dos especies que participan en el segundo pKa de la adenina. Se ha podido caracterizar mediante ATR-SEIRAS la adsorción de la forma aniónica de la adenina y determinar el valor del pKa2 en la interfase. El valor encontrado es muy próximo al de la adenina en disolución lo que confirma el modelo de adsorción previamente propuesto por el grupo de investigación en el que los sitios de interacción de la molécula con el electrodo no incluyen la participación del nitrógeno (N9) que experimenta la desprotonación en el segundo equilibrio ácido-base. En cuanto a los estudios de la adsorción de la timina en el rango de pH 1 a 12 se ha podido determinar la estabilidad de los diferentes tautómeros de la timina. Los espectros de ATR-SEIRA muestran que, independientemente del valor del pH, la interacción con la superficie nanoestructurada de oro se produce por los tautómeros desprotonados de la timina. En base a cálculos DFT, se comprueba que en medio ácido se adsorbe sobre oro el tautómero desprotonado en N3, mientras en el medio básico lo hace el tautómero desprotonado en N1. Además, la deconvolución de las señales obtenidas en el espectro de ATR-SEIRA a pH neutro pone de manifiesto que ambos tautómeros coexisten a pH 7. A partir de la deconvolución y determinación de intensidades de las señales correspondientes a los modos normales de vibración de tensión de CH y CH3 de la molécula de timina se propone un modelo de adsorción para los diferentes tautómeros y los cambios que sus orientaciones con el potencial eléctrico. Así, a pH ácido,se ha propuesto que el tautómero desprotonado en N3 interacciona a potenciales bajos mediante el grupo carbonilo C2O y reorienta su plano molecular al aumentar el potencial para permitir la interacción con la superficie del electrodo también por el nitrógeno N3 y el carbonilo C4O. A valores de pH básicos se ha propuesto que la interacción del tautómero desprotonado en N1 con el electrodo implica los grupos N1 y C2O en todo el rango de potenciales. Por último, en el capítulo 3 se ha abordado la co-adsorción de las bases complementarias timina y adenina sobre superficies nanoestructuradas de Au a diferentes valores de pH. Los resultados de ATR-SEIRAS muestran que el cambio de intensidad en las señales de adenina y timina puede estar provocado por variaciones en la organización molecular sobre el electrodo de Au. Estas variaciones implican un aumento en el ángulo de inclinación molecular respecto al electrodo para el caso de la adenina y una disposición paralela al electrodo para el caso de la timina. El alto límite de detección de la metodología ATR-SEIRAS ha permitido comprobar que el efecto de la presencia de las dos bases complementaria parece ser cooperativo y se detecta incluso con muy bajas concentraciones de adenina. En el capítulo 4 se presenta el estudio mediante EIS de la cinética de adsorción de la adenina sobre electrodos Au(111) en medios de pH ácido, neutro y básico. Se ha pretendido de esta forma caracterizar la cinética de adsorción de las tres formas de la adenina que existen en los tres medios. El grupo de investigación había aplicado previamente esta metodología electroquímica a la adsorción de la forma neutra de la adenina, pero en vista de los resultados espectro-electroquímicos en medio ácido que indican la desprotonación previa a la adsorción de la forma catiónica, se ha extendido el análisis a un rango más amplio de valores de pH. Ha sido preciso para ello desarrollar la teoría que permite deducir las ecuaciones de impedancia para el modelo de adsorción que incluye una etapa de desprotonación previa a la adsorción. Las nuevas ecuaciones de impedancia implican una dependencia de la impedancia con la frecuencia de la perturbación de alterna de la técnica distinta de la que cabe esperar para un modelo simple de adsorción que solo está controlado por la difusión del adsorbato y/o por la activación del proceso de adsorción química. Sin embargo, se distinguen casos límites (de alta y de baja frecuencia) en los que la dependencia con la frecuencia de la impedancia del modelo que incluye la etapa química es idéntica a la del modelo de adsorción simple. En base a dichas ecuaciones se propone el análisis de los datos experimentales en función de la frecuencia y se determinan los parámetros característicos de la cinética de la adsorción en función del potencial eléctrico. Del análisis de dichos parámetros se ha podido determinar en medios ácidos la constante de equilibrio para la desprotonación de la adenina, y las variaciones de la función que incluye las constantes de velocidad de la adsorcióncon el potencial, en los tres medios considerados. El capítulo 5 explora la adsorción y co-adsorciones de guanina y citosina sobre electrodos de oro a tres valores de pH que comprenden medios ácidos, neutros y básicos, con objeto de estudiar las adsorciones de las especies con distinto grado de protonación de las bases y de establecer el rango de potenciales en los que las dos bases pueden adsorberse simultáneamente. Sin embargo, no se ha sobrepasado el segundo pKa por ser demasiado alto y afectar la estabilidad de las nanoestructura del electrodo de oro. La comparación de los espectros de ATR-SEIRA para la citosina con los correspondientes espectros de transmisión en la región de 1300-1800 cm-1 ha permitido decidir que la forma neutra de la citosina se adsorbe en todos medios. Ello implica que en medio ácido la adsorción debe incluir una etapa de desprotonación previa. El análisis de detallado de las intensidades integradas de las señales de los espectros de ATR-SEIRAS ha permitido detectar que en medios neutros o ligeramente básicos y a bajos potenciales se adsorben dos especies distintas de citosona, lo que sugiere la posibilidad de tautómeros distintos. Los cálculos mediante DFT de los espectros de las moléculas aisladas y de las moléculas adsorbidas sobre clústeres de oro de los distintos tautómeros ha permitido asignar las señales de los espectros FT-IR y proponer el tautómero más estable en estado adsorbido así como el modelo de adsorción. Los estudios espectro-electroquímicos similares para la guanina realizados a los mismos valores de pH que los de la citosina han permitido concluir que en medios neutros y ácidos se adsorbe la guanina neutra mientras que en medios fuertemente básicos lo hace la forma aniónica y proponer las orientaciones moleculares de dichas formas sobre el electrodo, así como los sitios de interacción con el mismo en cada caso. En los estudio de las co-adsorciones de las bases sitosina y guanina se han observado efectos muy parecidos a los ya comentados para el caso de las co-adsorciones adeninatimina, que se han atribuido de igual forma a una orientación más paralela de la citosina y más perpendicular de la guanina respecto a la superficie electródica. El capítulo 6 corresponde a la segunda parte de la tesis y en el mismo se presenta la preparación, caracterización electroquímica y espectro-electroquímica de monocapas y bicapas de Langmuir en las que participa el nucleolípido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- citidina (que contiene la base citosina), adsorbidas sobre electrodos de oro Au(111). En estos casos ha resultado particularmente interesante la utilización de la modalidad PMIRRAS de la espectroscopia FT-IR. Los estudios comprende las estructuras que se obtienen tanto en ausencia como en presencia de la guanina. Las asignaciones de las señales ha sido posible por comparación con los espectros de transmisión del nucleolípido y de la citosina así como de los de ATR-SEIRA de las bases adsorbidas. Los resultados indican que la monocapa se une a la superficie del electrodo a través del grupo citosina. La presencia de guanina en el medio induce la adsorción de la misma sobre el electrodo que induce una reorientación de la citosina hacia una disposición más plana respecto a la superficie el electrodo, como en el caso de las co-adsorciones guanina citosina. El cálculo de los ángulos de inclinación de la cadena carbonada respecto a la superficie del electrodo sobre la base de las intensidades de las señales de los modos característicos de vibración de dichas cadenas, permite decidir acerca del grado de organización de las monocapas. Se han preparado bicapas que expongan la parte hidrofílica del nucleolípido, que incluye la citosina, hacia la disolución mediante el uso de un derivado tiólico de cadena alifática similar a la del nucleolípido. Dichas bicapas se han caracterizado de manera similar al caso de las monocapas. Los resultados de PM- IRRAS han permitido decidir acerca de la organización tanto en ausencia como en presencia de guanina y se han alcanzado conclusiones de interés con vistas a las posibilidades del uso de las mismas con fines de reconocimiento molecular. Finalmente, en el capítulo 7 se recogen las conclusiones más relevantes de esta tesis.