Estudios sobre mutantes auxotróficos y simbióticos producidos por transposición con Tn5 en Rhizobium trifolii

Abstract

Desde el punto de vista práctico, la fijación simbiótica del nitrógeno es con mucho la más importante de las modalidades de fijación de este elemento y hacia ella se dirigen hoy día la mayoría de las investigaciones con el objetivo de incrementar la eficacia de la fijación biológica del nitrógeno. En el momento actual, el estudio de la simbiosis Rhizobium-leguminosa en todos sus aspectos es el único que puede reunir a corto plazo resultados que permitan aumentar la eficacia de la fijación biológica del nitrógeno y que repercutan positivamente en la producción vegetal. El uso de inoculantes comerciales en el cultivo de leguminosas se ha encontrado siempre con el problema de la incapacidad de las razas de Rhizobium para mantener las propiedades simbióticas tras su introducción en el suelo. En particular ciertas razas muestran un rápido deterioro tanto en su capacidad de fijación del nitrógeno como en su habilidad para nodular en la leguminosa hospedadora. Por ello y en lo que se refiere a la bacteria, los objetivos ideales a conseguir en las investigaciones, son los relativos a la selección de las cepas con un máximo de especificidad para una determinada planta, un máximo de infectividad para las raíces de la misma y un máximo de efectividad a la hora de la fijación del nitrógeno en los nódulos. Existe un interés considerable para caracterizar los genes responsables del establecimiento de la simbiosis entre cepas de Rhizobium y su hospedador especifico. La observación de que ciertas propiedades simbióticas tales como infectividad (Nod) y la efectividad (Fix) son inestables en determinadas cepas de Rhizobium unido a los estudios físicos y genéticos de las mismas indican que estas propiedades están localizadas en plásmidos. No obstante, distintos autores han demostrado que algunos genes reguladores de las características simbióticas van incluidos dentro del cromosoma bacteriano. La descripción en nuestro laboratorio de un plásmido implicado en el proceso de infección así como la elaboración de un mapa de ligamento en Rhizobium trifolii nos han proporcionado la base necesaria para continuar la investigación en la que se intenta localizar los genes de la nodulación y los de la fijación en dicha especie de Rhizobium. Nuestro objetivo prioritario ha sido estudiar las características simbióticas a través de mutantes auxotróficos y de resistencia. Aunque ya se ha descrito en nuestro grupo la utilización de la nitrosoguanidina para la obtención de mutantes auxotróficos, las dificultades en el uso de la misma así como su peligrosidad, nos ha inducido a emplear la mutagénesis biológica, en base a su sencillez y porque presenta la ventaja de que todos los mutantes obtenidos se pueden localizar, al producirse la inactivación del gen por introducción en el mismo del transposón utilizado. Este hecho, permite seleccionarlo fácilmente por su capacidad para crecer en medios adicionados del antibiótico adecuado. Los primeros estudios en este trabajo irán encaminados a profundizar en el comportamiento del transposón Tn5 en Rhizobium trifolli, así como del plásmido portador del mismo, pJB4JI. Las inserciones producidas por este mutágeno biológico nos permitirá aislar, purificar y caracterizar los mutantes auxotróficos que serán la base de nuestros estudios posteriores. Dado que las mutaciones producidas por Tn5 llevan implícita la resistencia a kanamicina, en los análisis de ligamiento será necesario utilizar plásmidos conjugativos cuyos marcadores de resistencia no interfieran con los del transposón. Por todo ello utilizaremos el plásmido pJB3JI que es un derivado KmS del R68.45 y que es portador de los genes de transferencia. La utilización de estas dos herramientas (mutantes auxotróficos y plásmido) nos permitirán la introducción de nuevos marcadores en el mapa de ligamento de Rhizobium trifolli. Todos los estudios que se hagan a continuación tratará de relacionar las mutaciones auxotróficas con posibles alteraciones de las características simbióticas y se estudiarán todos los aspectos que interaccionan entre ambas. La posible localización, tanto de los genes de la nodulación como la de los genes de la fijación, se estudiarán previo aislamiento de mutantes a los mismos, bien por su incapacidad para penetrar en la pared de la planta y formar nódulos en ella como su incapacidad para reducir el acetileno a etileno. La relación existente entre los diferentes mutantes auxotróficos obtenidos y su capacidad para nodular y fijar el nitrógeno atmosférico, se pondrá de manifiesto mediante la realización de procesos de transferencia genética entre cepas infectivas y efectivas y cepas defectuosas en dichas características y que presenten alguna alteración nutritiva. La complementación entre las mismas y la adquisición por parte de la cepa Nod- y/o Fix- del fenotipo simbiótico silvestre asociará de forma directa ambas características. Dado que el mecanismo de reconocimiento específico sugiere que los carbohidratos de la superficie bacteriana están envueltos en la interacción del microorganismo con la planta, se incluye también como objetivo del presente estudio la investigación de los polisacáridos extracelulares de los mutantes relacionados con el proceso de infección. CONCLUSIONES: 1. Se obtuvieron mutantes auxotróficos por transposición con Tn5 utilizando el plásmido pJB4JI. Los mutantes se clasificaron en 13 grupos fenotípicos distintos lo que demuestra que en el cromosoma de Rhizobium trifolii existen múltiples dianas de Tn5. 2. Las mutaciones de Rhizobium trifolii obtenidas por transposición con Tn5 son muy estables pues en la mayoría de los casos no se han obtenido revertientes siendo su frecuencia igual o superior a la espontánea. 3. En el mapa de ligamento de Rhizobium trifolii utilizando el plásmido pJB3JI se han introducido 17 marcadores. Siete coinciden con marcadores previamente descritos y diez son de nueva localización. 4. Por primera vez se describe la localización en el cromosoma de Rhizobium trifolii de marcadores auxotróficos y marcadores simbióticos obtenidos por Tn5. 5. Los resultados obtenidos en los experimentos con mutantes defectuosos en la nodulación indican que uno de los genes nod presenta localización cromosómica mientras que los seis restantes no. Estos últimos parecen tener su localización en el plásmido Sym. 6. Los 4 alelos fix localizados (fix-111, fix-223, fix-317 y fix-414) se encuentran irregularmente distribuidos en el cromosoma de Rhizobium trifolii. 7. La composición de los EPSs de los mutantes analizados no varía significativamente respecto a la de la cepa silvestre. Es por tanto difícil relacionar la composición del exopolisacárido con el proceso simbiótico.