Asimilación de nitrato en la leguminosa modelo Lotus japonicus

Abstract

Objetivos. 1. Debido a la poca información existente acerca de la asimilación de nitrato en Lotus japonicus al inicio de esta Tesis, el primer objetivo fue estudiar el crecimiento y la asimilación de nitrato (fundamentalmente niveles de actividad y proteína NR y NiR y acumulación de nitrato) en diferentes fuentes de nitrógeno y condiciones de cultivo. 2. Gracias a la disponibilidad de plantas transgénicas de Lotus japonicus transformadas con el gen de la NR de Lotus japonicus o de espinaca bajo el control de diferentes promotores (promotores constitutivos, específicos de raíces o específicos de tejidos verdes), otro objetivo fue estudiar la actividad y proteína NR en estas plantas, para comprobar si la expresión del transgén producía cambios en la distribución de la asimilación de nitrato entre las hojas y las raíces en Lotus japonicus, aspecto muy importante por ser ésta una planta asimiladora de nitrato en raíces. 3. Otro objetivo de esta Tesis ha sido la clonación del gen de la NiR y el estudio de la expresión de la NiR a nivel de actividad, proteínas y mRNA en diferentes condiciones de cultivo, completando así los estudios de Biología Molecular llevados a cabo para otras enzimas de asimilación de nitrato por otros grupos europeos. 4. Dado que la obtención de mutantes es una herramienta fundamental para el estudio de una ruta metabólica y el hecho de que Lotus japonicus sea una nueva planta modelo, uno de los objetivos más importante de esta Tesis ha sido poner en marcha un programa de mutagénesis, para la búsqueda de mutantes afectados en la asimilación de nitrato. CONCLUSIONES 1. Se ha examinado el crecimiento de Lotus japonicus en diferentes fuentes nitrogenadas, comprobándose que la mayor producción de biomasa tiene lugar cuando se utiliza el nitrato y el amonio simultáneamente como fuente de nitrógeno. El óptimo de crecimiento de Lotus japonicus, cultivada en nitrato potásico como única fuente de nitrógeno, tiene lugar a una concentración entre 4-8 mM, siendo tóxicas concentraciones superiores. 2. Lotus japonicus asimila el nitrato principalmente en raíces, siendo este un hecho característico de las leguminosas de clima templado, pero a diferencia de lo que ocurre en estas plantas, el aumento de la concentración de nitrato en el medio de cultivo no conduce a un desplazamiento de la asimilación de nitrato hacia las hojas. 3. Plantas de Lotus japonicus cultivadas en cajas de Magenta sufren una disminución de la asimilación de nitrato en raíces con el tiempo de cultivo. Esta disminución es independiente de la sal de nitrato utilizada, y no se debe a la ausencia de nitrato en el medio de cultivo o a un aumento en el pH externo. La caída de la asimilación de nitrato en raíces no va acompañada de un aumento de la asimilación de nitrato en hojas. Una situación similar se detecta también en cultivos en semilleros. 4. Tampoco se ha conseguido un cambio sustancial en la distribución de la asimilación de nitrato utilizando plantas transgénicas de Lotus japonicus sobreexpresando la proteína NR en hojas, o en plantas transgénicas que presentan disminuida la actividad NR en raíces. Debe existir, pues, un mecanismo de control global de la asimilación de nitrato en Lotus japonicus que la imposibilita para asimilar una mayor cantidad de nitrato en hojas. 5. Se ha aislado y secuenciado un cDNA de Lotus japonicus que se ha identificado como correspondiente al gen de la nitrito reductasa (Nii), siendo el primero descrito para esta enzima a partir de una genoteca de raíces de plantas y, además, de una planta asimiladora en raíces. La secuencia de aminoácidos de la NiR codificada por este cDNA se encuentra precedida por un péptido señal de 19 aminoácidos. Por comparación de la secuencia de aminoácidos deducida para la NiR de Lotus japonicus con las secuencias de las NiR de diferentes organismos fotosintéticos, se ha comprobado la presencia en dicha secuencia de los cuatro residuos de cisteína implicados en la unión de los grupos prostéticos de la NiR, así como una región en la zona N-terminal rica en aminoácidos positivos que podría interaccionar con la Fd. También ha permitido la construcción de un árbol filogenético, en el que la NiR deducida para Lotus japonicus se encuentra situada dentro del grupo de las leguminosas pero separada de las leguminosas tropicales asimiladoras de nitrato en hojas. Se ha determinado una única copia del gen Nii por genoma haploide en Lotus japonicus. 6. Los estudios de expresión a nivel de actividad, proteína y mRNA de la NiR de Lotus japonicus, han puesto de manifiesto la dependencia de la inducción de la NiR por nitrato, siendo esta a nivel transcripcional, así como la ausencia de fluctuaciones a lo largo del fotoperiodo tanto en raíces como en hojas. Los niveles de mRNA para la NiR también están sometidos a un control por la limitación de espacio para el crecimiento de la raíz. 7. Se ha llevado a cabo un programa de mutagenesis in vivo de semillas de Lotus japonicus que ha revelado que el agente mutagénico químico EMS es más eficaz que la irradiación ionizante γ. Las semillas mutagenizadas se han utilizado para aislar mutantes afectados en la asimilación de nitrato en Lotus japonicus, utilizando como método de selección la resistencia a clorato. Con este propósito se ha estudiado la toxicidad a clorato en esta planta encontrándose que el clorato per se no es capaz de inducir la actividad NR de Lotus japonicus. Por este motivo es necesario la presencia de nitrato en el medio de selección, debiendo ser la relación molar nitrato:clorato inferior a 5:1 si se quiere evitar la protección del nitrato frente a los efectos tóxicos del clorato. Además, se ha determinado que la concentración de clorato no puede ser mayor de 3 mM, si se quieren germinar las plantas directamente en el medio de selección. Con este método se han podido aislar en Lotus japonicus dos mutantes resistentes a clorato (clor1 y clor2), que heredan el carácter mutante en el 100% de la progenie, si bien la resistencia es tan solo parcial, siendo las plantas sensibles a altas concentraciones de clorato, aunque mucho menos que la estirpe silvestre. Estos mutantes no presentan alterados los niveles de actividad NR ni del nitrato acumulado, por lo que pueden estar afectados en algunos de los sistemas bifuncionales de transporte de clorato/nitrato de baja afinidad. 8. Se han podido aislar también en Lotus japonicus tres mutantes fotorrespiratorios de GS (pr1, pr2 y pr3) afectados específicamente en la isoforma plastídica, siendo Lotus japonicus la segunda especie vegetal y primera leguminosa donde se logran este tipo de mutantes. Aunque no se detecta actividad enzimática alguna asociada a la isoforma plastídica, el mutante pr1 presenta bajos niveles del polipéptido correspondiente a la isoforma plastídica y el mutante pr2 niveles indetectables. Este hecho, junto con los estudios genéticos realizados apuntan a que dichos mutantes están originados por diferentes mutaciones. La disminución de la cantidad de subunidad plastídica tiene lugar tanto en hojas como en raíces, lo que apoya la existencia de un solo gen que codifica para la GS plastídica en esta planta, y que la GS plastídica no es esencial para este proceso. 9. La transferencia de los mutantes pr1 y pr2 desde una atmósfera enriquecida en CO2 (condición no fotorrespiratoria) a aire (condición fotorrespiratoria) produce un aumento de 50 veces de contenido de amonio intracelular en hojas, corroborando el papel de la isoforma plastídica en la reasimilación del amonio que se libera por fotorrespiración. El buen crecimiento de los mutantes fotorrespiratorios de Lotus japonicus en alto CO2 y en presencia de nitrato, junto con el hecho de que los niveles de actividad total GS en raíces del mutante pr1 y el silvestre sean similares, indica la participación mayoritaria de la GS citosólica en la asimilación primaria del nitrógeno en esta planta, y que la GS plastídica no es esencial para este proceso. 10. Las actividades GS, NR y NiR no se afectan en las transiciones de alto CO2 a aire, ni en el organismo silvestre ni en el mutante pr1, indicando que el cambio metabólico producido por la ausencia de la reasimilación del amonio, ni el amonio fotorrespiratorio per se, influyen en dichas enzimas. 11. El perfil de elución de las isoformas de GS en una cromatografía de intercambio iónico para extracto crudos de Lotus japonicus es característico de esta planta y diferente del descrito para la inmensa mayoría de las especies vegetales estudiadas, en que primero eluye la isoforma plastídica y después la citosólica. Por este motivo, es recomendable no utilizar la terminología GS1 y GS2 para referirse a las isoformas citosólica y plastídica, respectivamente. También sería preciso revisar aquellos estudios sobre las proporciones de ambas isoformas basados exclusivamente en esta técnica.