Contribución a la caracterización y estandarización de extractos alergénicos de polen de Olea europea. (Estudio agronómico-botánico, microscópico, alergológico y bioquímico con 16 cultivares de olivo)

Abstract

Llevados por el deseo de contribuir a un mejor conocimiento del polen del olivo en lo que interesa al campo de la alergia, decidimos plantear nuestro trabajo en una doble dimensión: primeramente, profundizando en las características diferenciales que ya a primera vista muestran, desde un punto de vista agronómico estos árboles, lo cual ha abocado al reconocimiento de numerosas “variedades” de olivos de cultivo (diferentes cultivares) y, de otra parte, investigando desde el punto de vista de su funcionamiento alergénico los pólenes de 16 cultivares sembrados como distintas “variedades agronómicas” en un mismo campo experimental de nuestra provincia y tratar de averiguar si estas diferencias morfológicas podrían traducirse en diferencias en su constitución bioquímica y en su alergenicidad (sabiendo que la mayor parte de la alergenicidad de los pólenes es atribuida a constituyentes de su membrana de cobertura). En primer lugar realizamos un análisis de las características morfológicas de árboles, ramas, ramos, hojas, inflorescencias, fruto y hueso, confirmando las diferencias descritas en la literatura agronómica sobre los cultivares elegidos; así como estudiamos desde un punto de vista microscópico la morfología de la membrana de cobertura de los pólenes de cada uno de los cultivares con microscopio óptico y microscopio electrónico de barrido que nos ofrece datos de su estructura tridimensional, no habiendo hallado caracteres diferenciales a éste nivel. Elegimos a continuación una población de pacientes sensibles a pólenes de olivo y, estudiamos la actividad y potencia alergénica de los 16 extractos polínicos elaborados (y de otros extractos de polen de olivo de distribución comercial en general, exceptuando el extracto PJ cedido por otro grupo investigador, y que sirvieron como “grupo comparativo”). Realizamos técnicas “in vivo” e “in vitro”, analizando tanto la respuesta global de la población de enfermos como la individualizada frente a cada uno de los extractos incluidos en el trabajo. Hemos hallado diferencias con significación estadística en el funcionamiento alergénico entre los 16 extractos y con aquellos del “grupo comparativo”. Sometimos además a enfoque isoeléctrico los diversos extractos en estudio, presentando por vez primera los patrones de isoelectroenfoque de 16 cultivares de olivo, habiendo hallado entre ellos diferencias destacables y elaborando un patrón prototipo con 6 áreas principales de localización de bandas protéicas a partir de rasgos comunes entre ellos. Se destaca la importancia alergénica de ciertas bandas y la gran variabilidad en la proporción de proteínas que cada extracto posee en áreas más o menos comunes e importantes desde el punto de vista alergológico, y destacamos a partir de ello el interés que este hecho puede tener para prestar un nuevo enfoque a la investigación sobre caracterización, purificación y estandarización de extractos de polen de olivo. Dado el planteamiento general de nuestro trabajo, hemos creído conveniente englobar las conclusiones en dos grupos: A. BOTANICO AGRONOMICAS 1. Existen diferencias morfológicas entre las distintas variedades o cultivares de olivo estudiados, tras el examen directo de la planta, más evidentes cuando son comparados sus frutos. 2. Hemos podido corroborar que el ecoambiente y cuidados culturales, son factores con capacidad de inducir cambios cualitativos –fundamentales desde el punto de vista alergológico- en una variedad o cultivar determinado, lo cual podría abocar con el tiempo en el reconocimiento de una nueva variedad agronómica. 3. Reafirmamos, junto con la gran mayoría de botánicos, la conveniencia de hablar preferentemente de “cultivares” y no de variedades en el pleno sentido del término, puesto que no estamos en condiciones de determinar aún, hoy día, cuales serían las características de importancia, comunes entre ellas y constantes, desde el punto de vista de su constitución bioquímica. 4. No existen diferencias morfológicas evidentes en la cobertura del grano entre los diversos pólenes, examinados mediante microscopía óptica y electrónica. 5. Damos a conocer por vez primera en la literatura científica, los diferentes patrones que configuran mediante isoelectroenfoque, diversos cultivares de Olea Europea, situados en un mismo ecoambiente y bajo idénticos cuidados. Cada uno de ellos ha sido examinado como “variedad agronómica”, puesto que con esas atribuciones fueron sembrados, habiendo confirmado previamente la persistencia de las cualidades morfológicas fundamentales que desde el punto de vista agronómico y de modo tradicional, se examinan en un árbol, para la delimitación de su variedad. B. DEL ESTUDIO ALERGOLOGICO. 1. Los extractos estudiados han mostrado diferencias con significación estadística en actividad y potencia alergénicas en su análisis tanto por técnica “in vitro” como por técnicas “in vivo”. Los resultados han sido correlacionables por las tres técnicas cuantitativas (excepto en lo que respecta a 3 de los 16 cultivares en estudio, objeto de comentario en el capítulo anterior) y justificables tras observación de los distintos patrones producidos con el enfoque isoeléctrico de cada extracto. Basados en los resultados globales de nuestro trabajo, extraemos además ciertas conclusiones indirectas que quedan enumeradas a continuación. 2. Afirmamos que las proteínas de mayor interés alergénico en el polen de Olea Europea (alérgeno “mejor”), poseen un punto isoeléctrico de valor próximo a 6, en consonancia con lo publicado por BLANCA M. et al. en 1983. (Estas proteínas han sido comunes sin excepción en los extractos con amplia actividad alergénica y ausentes por completo en todo aquellos extractos de escasa actividad y potencia alergénica según todos los tests realizados). 3. Estamos en condiciones de resaltar, a partir del comportamiento de extractos como el de variedad CAÑIVANO BLANCO y el de variedad LECHIN, la indudable importancia como alérgenos “minor” de proteínas con punto isoeléctrico alrededor de 8,5 y, y en el otro extremo del rango de pH, aquellas con plm4 (zona horaria en la lectura del densitómetro = 3,15 minutos) y las de pl alrededor de 3,5 (zona horaria = 3,60-375). 4. Las proteínas con pl alrededor de 3,5 son de presumir como las directamente responsable de la buena respuesta de los extractos CAÑIVANO BLANCO, CAÑIVANO NEGRO y LECHIN en determinados pacientes (escasos dentro de la población total). 5. La distancia mayor entre extractos de variedades de tronco común y con características agronómico-botánicas idénticas, la hemos descubierto entre el cultivar correspondiente al de variedad PICUAL sembrado y crecido en nuestra provincia y aquel que nos fue enviado desde Jaén. Hacemos destacar que tanto el método de valoración protéica como el método de extracción de los componentes del grano de polen fueron muy distintos y no es posible por ello comparar ambos resultados estrechamente. Realizamos una vez más la necesidad de estandarizar la metodología a seguir en este campo entre los diversos laboratorios de investigación. 6. Ambas variedades PICUAL tienen en común 8 bandas protéicas. (Existe en total 16 bandas en el extracto PJ y 12 en el extracto Pc). la ausencia más importante de resaltar en aquel de menor actividad alergénica es la de aquellas bandas con punto isoeléctrico alrededor de 7 (zona horaria 1,20 minutos) y 5,5 (zona horaria 2.55), lo cual reafirma la importancia de estas bandas desde el punto de vista alergológico. 7. Subrayamos especialmente la importancia alergénica de la proteína enfocada en el punto isoeléctrico de valor 5.5, después de analizar, junto a otros datos, los rendidos por el extracto de variedad ZORZALEÑA. 8. Corroboramos lo afirmado por múltiples autores acerca de la ineficacia de la dosificación de los extractos en virtud de mediciones de su contenido proteico, habiendo comprobado la total falta de correlación de esta metodología con cada uno de los métodos que tratan de medir únicamente la proteína biológicamente activa que cada extracto contiene. 9. Apoyamos el criterio de la individualidad de respuesta incluso dentro de los enfermos atópicos “hiperrespondedores”, tanto en calidad como en potencia. Este rasgo, bien comprobado y expuesto en nuestro estudio se halla en consonancia con las leyes de control genético de la respuesta inmune de clase IgE, expuestas fundamentalmente por DE WECK A.L. y MARSH D.G. 10. Creemos haber hecho destacar a través de nuestro estudio el gran interés que posee el conocimiento de los distintos cultivares de Olea Europea desde diversos puntos de vista, puesto que en consonancia con botánicos y agrónomos puede ello ayudar desde un punto de vista médico al menos en dos formas distintas. A. Para tratar de cultivar con mayor profusión dentro de las variedades con buen rendimiento agrícola, aquellas con menor potencia alergénica. B. Tratar de destinar a la investigación aquellas variedades que nos muestran de modo natural, fracciones que sabemos de interés fundamental; y destinar a diagnóstico e hiposensibilización terapéutica, solamente aquellas que tienen elevada potencia alergénica y escasas proteínas de interés dudoso, a través de los estudios ya realizados sobre esta especie polínica.