Structural approach to the hur function

Abstract

En esta tesis se presenta un análisis estructural de la proteína de unión a ARN HuR y, en particular, se profundiza en el análisis con su estructura modular y a su regulación post-traducional mediante fosforilación. Los resultados obtenidos revelan que los dominios N-terminales RRM1 y RRM2 de HuR funcionan como una unidad, según se deduce de los datos de la estabilidad térmica con las construcciones de uno y dos dominios. Los mutantes S88D, S100D y S158D que mimetizan fosforilación, diseñados sobre la construcción RRM12, muestran cambios despreciables en la estructura secundaria respecto a la proteína silvestre. La Tm del mutante S100D no cambia respecto a la de la proteína silvestre, mientras que el mutante S88D es más estable y la especie S158D se desestabiliza ligeramente debido a la mutación que mimetiza la fosforilación. En cuanto a las propiedades de unión a ARN, las especies RRM12 S88D y RRM12 S100D mostraron KDs parecidas a la proteína silvestre, mientras que el mutante S158D presenta una afinidad 4 veces mayor que el silvestre por la secuencia de ARN 5¿-AUUUUUAUUUU-3¿ del c-fos.

El dominio C-terminal de HuR (RRM3) se comporta en disolución de forma independiente a la unidad RRM12. Se ha desarrollado, por primera vez, una estrategia innovadora basada en detergentes para solubilizar el módulo RRM3. Los modelos calculados para la proteína silvestre y el mutante fosfomimético S318D basados en restricciones de RMN y generados con el servidor CS23D, reflejan la topologia canónica de los dominios RRM (ß1¿1ß2ß3¿2ß4). En el sitio de unión a ARN de RRM3 se encuentran las dos hebras ß centrales ß1 y ß3, aunque también se puede extender a toda la lámina ß. Además, la proteína silvestre RRM3 parece unirse al oligonucleótido 5¿-UUUUU-3¿ con una afinidad mayor que al 5¿-AUUUA-3¿. La presencia de un residuo cargado negativamente en la posición 318 dificulta el reconocimiento por el ARN.

La región comprendida entre el Trp261 y la Thr271 de HuR RRM3 alberga residuos responsables de la dimerización, tanto en presencia como en ausencia de ARN. De hecho, la sustitución del Trp por Glu en el mutante W261E RRM3 desplaza el equilibrio monómero/dímero característico de la proteina HuR RRM3 silvestre hacia la forma monomérica.

Los resultados de esta tesis han dado lugar a la publicación de un artículo en una revista de alto impacto y a otro enviado:

1. Scheiba RM, Aroca A, Díaz-Moreno I (2012) HuR thermal stability is dependent on domain binding and upon phosphorylation. Eur Biophys J 41:597-605

2. Scheiba RM, Ibañez Opakua A, Oyenarte I, Díaz-Quintana A, Martínez-Chantar ML, Martínez-Cruz LA, Blanco FJ and Díaz-Moreno I (2012) Shedding light on the most C-terminal RNA binding motif of HuR: its role in RNA recognition (enviado).