Mecanismos de resistencia a Carbapenemas en cepas clínicas de Acinetobacter baumannii

Abstract

En los últimos años se ha producido un incremento significativo en el número de infecciones nosocomiales causadas por cepas de Acinetobacter baumannii resistentes a carbapenemas. Las opciones terapéuticas en el tratamiento de estas infecciones son muy limitadas, llegando a requerirse el uso de antimicrobianos de elevada toxicidad (polimixinas). Las bases bioquímicas y moleculares de los mecanismos de resistencia a carbapenemas en Acinetobacter baumannii son aún poco conocidas. El estudio de los mecanismos de resistencia para este grupo de antimicrobianos permitirá un mejor conocimiento de la epidemiología de los brotes producidos por estos microorganismos, y podría ayudar a la búsqueda de nuevas drogas que inhiban o bloqueen algunos de estos mecanismos de resistencia. Las hipótesis de trabajo de este estudio fueron las siguientes: 1. La resistencia a carbapenemas en Acinetobacter baumannii está relacionada con producción de β-lactamasas con actividad hidrolítica frente a carbapenemas, alteraciones en el perfil de proteínas de membrana externa (OMPs) y/o modificaciones en el patrón de proteínas fijadoras de penicilina (PBPs). 2. Los mecanismos de resistencia a carbapenemas en Acinetobacter baumannii no actúan de forma independiente, sino que se expresan conjuntamente para reducir la actividad de estos antibióticos. Para demostrar la validez de esta hipótesis se establecieron los siguientes objetivos: 1. Caracterización fenotípica y genotípica de los aislamientos de Acinetobacter baumannii, mediante un sistema de pruebas bioquímicas (biotipia) y el análisis electroforético en campo pulsante de los fragmentos de restricción de ADN cromosómico de cada aislamiento (pulsotipia). 2. Estudio de la actividad hidrolítica de extractos enzimáticos frente a cefaloridina, imipenema, meropenema y oxacilina, empleando espectrofotometría UV y ensayos microbiológicos, caracterización de β-lactamasas mediantes isoelectroenfoque, y determinación de su punto isoeléctrico y su perfil de inhibición en presencia de ácido clavulánico, cloxacilina o EDTA. 3. Análisis del perfil de OMPs mediante electroferesis de geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). 4. Caracterización de los patrones de protéinas fijadoras de penicilina mediante ensayos de fijación de envueltas celulares con I125-ampicilina, fraccionamiento de las proteínas marcadas radioactivamente mediante electroferesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), y deteción y cuantificación de dichas proteínas mediante autorradiografía. CONCLUSIONES: 1. El método de tipado bioquñimico (biotipia) de los aislamientos de Acinetobacter baumannii posee menor pode de discriminación que el método de tipado genotípico (genotipa) mediante electroforesis en campo pulsante, aunque la asimilación de malonato permite incrementar la capacidad discriminatoria del mismo. 2. La disminución de las CMI90S de imipenema y meropenema en presencia de BRL 42715 (64 y 2 veces, respectivamente) y la ausencia de sinergia entre estas dos carbapenemas y el ácido clavulánico demuestran que la resistencia a imipenema está mediada por producción de β-lactamasas de serina no inhibibles por ácido clavulánico, mientras que la resistencia a meropenema está relacionada, además de la producción de β-lactamasas, con otros mecanismos. 3. La sensibilidad del método espectrofotométrico para detectar hidrólisis de imipenema, meropenema y oxacilina es similar a la del método de la hoja de trébol, pero superior a la del método del doble disco. El método del doble disco es poco sensible cuando los extractos crudos poseen escasa actividad hidrolítica frente a β-lactámicos. 4. En los aislamientos de Acinetobacter baumannii sensibles a carbapenemas la hidrólisis de cefaloridina depende de la expresión de una β-lactamasa de tipo AmpC, con punto isoeléctrico ≥9, cuya actividad se asocia con sensibilidad disminuida cefalosporinas. En los aislamientos resistentes a carbapenemas la hidrólisis de cefaloridina se correlaciona parcialmente con la actividad de los β-lactámicos evaluados, incluidas las carbapenemas, debido a que, en estos aislamientos, además de AmpC, se expresan otros tipos de β-lactamasas que pueden hidrolizar cefalordina con distinta eficacia. Por esta razón, el análisis espectrofotométrico de la hidrólisis de cefaloridina en una cepa determinada no es indicativo del papel directo de la o las β-lactamasas en la resistencia a carbapenemas. 5. La resistencia a carbapenemas en nuestros aislamientos de Acinetobacter baumannii depende de la actividad hidrolítica de la(s) oxacilinasa(s) de pl 6.3 y 7.0, respectivamente, frente a oxacilina, imipenema y meropenema, y de la presencia de una metalo-β-lactamasa de punto isoeléctrico 5.8. 6. De los 9 sistemas de geles de poliacrilamida empleados para separar las OMPs de Acinetobacter baumannii el constituido por policrilamida al 10% más urea 6M es el más adecuado para el estudio de dichas proteínas. 7. En 4 aislamiento de Acinetobacter baumannii la resistencia a imipenema y meropenema se asocia con la ausencia de una OMP de 22.5 kDa. 8. En Acinetobacter baumannii la ausencia de una PBP de 73.2 kDa (PBP 2a) se relaciona con resistencia a imipenema y/o meropenema de bajo nivel (CMIs de 4 mg/L), mientras que la ausencia simultánea de esta PBP y otra de 70.1 kDa (PBP 2b) se asocia con niveles de resistencia más elevados frente a ambos compuestos (CMIs de 8-32 mg/L). 9. En los aislamientos de Acinetobacter baumannii evaluados la resistencia a imipenema y meropenema es multifactorial, estando relacionada con la producción de β-lactamasas con pls de 6.3, 7.0 y 5.8, respectivamente y con la ausencia de dos PBPs de 73.2 kDa y 70.1 kDa. En algunos aislamientos dicha resistencia se relaciona, además, con la ausencia de una OMP de 22.5 kDa.