A sequential procedure for the quantification of biologically produced polyphosphate in sediment samples

Abstract

Polyphosphate (poly-P) is a phosphate storage compound widespread in prokaryotic and eukaryotic cells. Its quantification, however, is not yet well developed for sediment samples because of the difficulties associated with using a single extractant to extract a specific P compound without altering others. The present work uses an analytical procedure already developed to measure poly-P in algal cultures and later modified here for sediments to study poly-P in the sediment. The procedure uses the Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) method for sequential P-fractionation. This approach ensures that the main inorganic phosphate compounds (i. e. , Fe- and Ca-bound phosphate) are extracted prior to poly-P quantification. We applied this method to suspensions likely to contain biologically produced poly-P, such as laboratory cultures of Synechocystis PCC 6803 (Cyanobacteriaceae), Anabaena variabilis (Cyanobacteriaceae), and Chlorella sp. (Chlorophyceae) growing in a Penriched medium, and activated sludge. According to this procedure, the concentrations of poly-P in Synechocystis PCC 6803, Anabaena variabilis and Chlorella cultures were 15. 4, 6. 2 and 7. 2% of the sum of all P-fractions, respectively, whereas activated sludge showed a lower percentage (3. 7 %). Known volumes of these suspensions and a commercially available synthetic poly-P standard (Trimetaphosphate) were added to natural sediment. The P-composition of each sample was then compared in duplicate to the corresponding control samples (sediment alone). Poly-P in all control sediment samples was extremely low (0-2 μg g−1 d. w. ). It increased in all sediment suspensions to which biological samples had been added. The increase was particularly noteworthy for Synechocystis (up to 220 μg g−1 d. w. of poly-P). The recovery of poly-P in sediment samples to which Anabaena cultures had been added showed some deviation from a 1:1 expected:observed ratio, particularly when 2 ml of the culture were added (ratio of 0. 79). However, the recovery improved to 1. 12:1 when a larger volume was added (5 ml), probably owing to the inhomogeneous nature of the cyanobacteria culture. In contrast, the addition of 500 mg of trimetaphosphate to the control sediment did not significantly increase (p > 0. 05) the percentage found for the observed poly-P fraction. Consequently, biologically produced poly-P can be associated with the fraction of poly-P extracted through use of this procedure.

El polifosfato (poly-P) es un compuesto de reserva de fosfato ampliamente distribuido entre células procariotas y eucariotas. Sin embargo, aún no está bien definida la metodología para su cuantificaci´on en muestras de sedimento, debido a la dificultad de encontrar un único extractante para compuestos espec´ıficos de P que no altere a los demás. En el presente trabajo se sigue un procedimiento analítico para medir poly-P en cultivos de algas que posteriormente fue modificado para estudiar el poly-P en los sedimentos mediante el m´etodo EDTA de fraccionamiento secuencial de P y que permite extraer los compuestos de P inorgánico (P adsorbidos a Fe y Ca) antes de cuantificar el poly-P. Hemos utilizado esta metodología en suspensiones que contenían poly-P producido biológicamente, como cultivos de laboratorio enriquecidos en P de Synechocystis PCC 6803 (Cianobacteria), Anabaena variabilis (Cianobacteria), y Chlorella sp. (Clorofita), así como en fangos activados de depuradora. Siguiendo este procedimiento, las concentraciones de poly-P en los cultivos de Synechocystis PCC 6803, Anabaena variabilis, y Chlorella sp. supusieron el 15. 4, 6. 2 y 7. 2% de la suma de todas las fracciones de P, respectivamente, mientras que los fangos activados alcanzaron porcentajes menores (3. 7 %). Se enriquecieron suspensiones de sedimento natural con volúmenes conocidos de las anteriores suspensiones y con un poly-P est´andar comercialmente disponible (Trimetafosfato); se comparó, en muestras duplicadas, la composición de P de estas suspensiones con sus correspondientes muestras de sedimento control. La concentración de poly-P determinada en las muestras de sedimento control fue extremadamente baja (0-2 μg g−1 p. s. ), pero ésta aumentaba en todas las suspensiones enriquecidas con las muestras biológicas, en particular con Synechocystis (m´as de 220 μg g−1 p. s. ). La ratio entre las concentraciones de poly-P esperadas y observadas en las muestras enriquecidas no fue exactamente 1:1, sino 0. 79 al añadir 2 ml y 1. 12 al incrementar el volumen añadido de cultivo de Anabaena (5 ml) debido, probablemente, a la falta de homogeneidad del cultivo de cianobacterias. Sin embargo, laadición de 500 mg de trimetafosfato, un compuesto sintético, a la muestra control de sedimento no incrementó significativamente (p > 0. 05) el porcentaje de la fracción de poly-P. Por tanto, el poly-P producido biológicamente se puede asociar a la fracción de poly-P extra´ıda siguiendo el procedimiento aquí presentado.