Interacción de mecanismos plasmídicos y cromosómicos de resistencia a Quinolonas en Escherichia coli y su efecto en la resistencia, fitness y toxicidad celular

Abstract

Las fluoroquinolonas, junto a los beta-lactámicos, son los antimicrobianos de mayor uso clínico. Por tanto la aparición de resistencia bacteriana frente a estos agentes supone un problema clínico de elevada importancia. Modificaciones en la estructura de las quinolonas, fundamentalmente fluoraciones en distintas posiciones del anillo 4-quinolona, han dado lugar a la aparición de un gran número de nuevas moléculas con gran actividad. Las quinolonas actúan uniéndose a la ADN-girasa (o bien a la topoisomerasa IV) en el momento en que se produce la reacción de topoisomerización del ADN, de modo que se forma, por medio de un cambio conformacional, un complejo quinolona-enzima-ADN muy estable que inhibe la actividad enzimática e impide el movimiento de la horquilla de replicación. Las quinolonas se usan en el tratamiento de gran variedad de infecciones intrahospitalarias y comunitarias. La aparición de resistencia a betalactámicos en enterobacterias hizo que las quinolonas fueran una buena alternativa para el tratamiento de infecciones causadas por estos microorganismos. El principal problema del uso de fluoroquinolonas ha sido la rápida aparición de resistencias a las mismas. La resistencia a quinolonas en bacterias Gram-negativas tiene su origen en la aparición de mutaciones cromosómicas que afectan a los genes gyrA y parC, principalmente, (codificantes de las subunidad A de la ADN-girasa y la topoisomerasa IV, respectivamente) y en los genes gyrB y parE, secundariamente (codificantes de las subunidades B de la ADN-girasa y la topoisomerasa IV, respectivamente). La adquisición de mutaciones en estos genes es secuencial y afecta a una región concreta de los mismos denominada QRDR (Quinolone Resistance Determining Region). Secundariamente, la sensibilidad a quinolonas puede verse reducida por bombas de expulsión activa o la disminución de la permeabilidad de membrana (9). En 1998 un grupo de investigación de la Universidad de Sevilla fue el primero en describir un mecanismo de resistencia a quinolonas mediado por plásmidos en una cepa clínica de K. pneumoniae aislada en Alabama, EEUU, mediado por el gen qnr (quinolone resistance), y actualmente denominado qnrA (14). Este gen presente en estructuras plasmídicas se relaciona con integrones de clase 1. qnrA codifica una proteína pentapeptídica (COG_1357S) de 218 aminoácidos que protege a la ADN girasa y a la topoisomerasa IV de la unión de las quinolonas. Este nuevo mecanismo de resistencia produce un efecto aditivo sobre los anteriormente mencionados, y en consecuencia un aumento significativo del nivel de resistencia a estos antimicrobianos. Cuando los plásmidos que contienen genes qnr son transferidos por conjugación confieren bajo nivel de resistencia al receptor. Su localización plasmídicas asociado al amplio uso actual de las quinolonas ha conducido a un aumento de este tipo de resistencias. En este sentido, en los últimos años se han descrito nuevos genes de tipo qnr relacionados con qnrA en elementos de transmisión horizontal y pertenecientes a la familia de proteínas con repeticiones pentapeptídicas, como son qnrB, qnrS, qnrC, qnrD, qnrVC. Todos ellos han sido descritos mayoritariamente en especies de enterobacterias de importancia clínica, e incluso qnrB ha sido descrito recientemente en Pseudomonas fluorescens de origen animal. Las proteínas resultantes de estos genes comparten entre un 32% y un 64% de identidad aminoacídica entre ellas, mostrando una elevada variabilidad de secuencia. Tras la descripción de qnrA, se observó que no todos los plásmidos que contenían qnrA transferían el mismo nivel de resistencia a quinolonas. Aquellos plásmidos que confieren mayor nivel de resistencia portaban, además de qnr, una variante alélica del gen de resistencia a aminoglucósidos aac(6')-Ib y que confiere resistencia a ciprofloxacino y norfloxacina mediante acetilación en el substituyente de piperazynil de estos antimicrobianos. Este gen presenta un prevalencia elevada, en torno al 20%, en los estudios realizados. Por último, dos sistemas de flujo asociados a plásmidos han sido descritos recientemente, QepA y OqxAB pertenecientes a las familias RND y MFS, respectivamente, con capacidad para reducir la sensibilidad frente a quinolonas en enterobacterias. Mientras OqxAB ha sido frecuentemente descrito en K. pneumoniae, la distribución de QepA parece ser menor. Estudios recientes muestran un aumento de la prevalencia de estos mecanismos de resistencia, tanto cromosómicos como plasmídicos. En nuestro país, la resistencia en E. coli de origen urinario a ácido nalidíxico y fluoroquinolonas ha aumentado hasta un 30% y 20%, respectivamente. La resistencia a fluoroquinolonas ha aumentado en otras enterobacterias, tales como el genero Enterobacter, importante causante de infecciones invasoras nosocomiales. Los plásmidos que contienen genes qnr incluyen también genes que codifican la producción de beta-lactamasas plasmídicas de tipo AmpC o betalactamasas de espectro extendido (BLEEs). Esto sugiere una posible relación genética entre la resistencia a betalactámicos y a quinolonas, fenómeno estadísticamente demostrado en cepas productoras de BLEEs. Además, la dispersión y emergencia de la resistencia por transferencia plasmídica es un factor a tener en cuenta. Datos de diferentes autores muestran que la expresión de los genes qnr (qnrA, qnrB, qnrS) en E. coli aumentan el valor de la Concentración Preventiva de Mutantes y la frecuencia de aparición de mutantes. El efecto aditivo de la mutación Ser83Leu en la ADN girasa y la expresión de los genes qnr en E. coli permite seleccionar mutantes de un solo paso con elevados niveles de resistencia a fluoroquinolonas. En este proyecto nos proponemos analizar la interacción de los nuevos mecanismos de resistencia a quinolonas mediada por plásmido descritos con mecanismos de resistencia cromosómicos. El desarrollo de estrategias efectivas que conduzcan a frenar el aumento de la resistencia a quinolonas requiere una mayor comprensión de los factores que conducen a este incremento. Previamente se ha descrito que algunas mutaciones cromosómicas que confieren resistencia a quinolonas producen una disminución del fitness bacteriano que a su vez produce la aparición de mutaciones compensatorias. Sin embargo, Marcusson et al. han publicado recientemente un estudio en el que se ha evaluado el papel de varias de las mutaciones cromosómicas más frecuentemente relacionadas con resistencia a quinolonas en una colección isogénica y su interacción con el fitness bacteriano. Estos autores demuestran que la adición de ciertas mutaciones, por ejemplo Ser80Ile en ParC sobre una cepa que contiene las mutaciones Ser83Leu y Asp87Asn en GyrA junto con una deleción en marR, incrementan el fitness bacteriano lo cual puede tener implicaciones en la evolución de la resistencia a quinolonas en ausencia de presión antibiótica. De este modo, mutantes con bajo nivel de resistencia a quinolonas pueden producir simplemente por selección natural (mejora de la tasa de crecimiento) la adquisición de mutaciones que incrementen el nivel de resistencia a quinolonas. El efecto que los mecanismos de resistencia a quinolonas mediada por plásmido sobre el fitness bacteriano es desconocido y por lo tanto su implicación en la aparición de resistencia de alto nivel frente quinolonas. Otro aspecto que parece relevante para comprender como afecta a la célula bacteriana la adquisición de plásmidos portadores de genes qnr, es el posible papel citotóxico derivado de su expresión, ya que los estudios bioquímicos de estos genes indican que interaccionan con las topoisomerasas bacterianas, las cuales son enzimas esenciales, y se comportan como inhibidores débiles que impiden la activación del sistema SOS. En este contexto, recientemente se ha publicado la caracterización de una proteína pentapeptídica obtenida del cromosoma de Enterococcus faecalis, EfsQnr. En un modelo heterólogo en E. coli la sobre-expresión de esta proteína produjo agrupación celular y perdida de viabilidad. Se desconoce si las proteínas derivadas de la expresión de genes qnr mediados por plásmido pueden ejercer un efecto similar y tener un coste biológico para las bacterias. Si esto fuese así podría explicar la frecuente perdida de los plásmidos portadores de estos genes en ausencia de presión antibiótica. Además podría abrir la puerta para un potencial uso de proteínas Qnr o similares como nuevos agentes antimicrobianos de naturaleza peptídica. Se estima que el 60% de las infecciones son producidas por bacterias constituidas en biocapas y no necesariamente en infecciones asociadas a materiales protésicos o biomateriales. La biocapas bacterianas son habitualmente resistentes a los antimicrobianos, incluídas las fluoroquinolonas, por diferentes mecanismos. Entre ellos se postula la posibilidad de que algunos genes de resistencia se híper-expresen cuando las bacterias se encuentran formando parte de biocapas. La expresión de los genes qnr en biocapas bacterianas es desconocida. Las diferencias en la expresión de los genes qnr pueden determinar una mayor resistencia de las biocapas bacterianas a la acción de las fluoroquinolonas. Finalmente, la potencial alteración del fitness bacteriano mediada por estos genes puede tener consecuencias en la formación de biocapas bacterianas. Las hipótesis de este estudio son las siguientes: 1. La asociación de mecanismos plasmídicos y cromosómicos de resistencia a quinolonas contribuye significativamente a aumentar la resistencia frente a estos antimicrobianos. 2. La producción de especies reactivas de oxigeno en respuesta a la acción de las quinolonas, y que se vincula a la actividad bactericida de estos antimicrobianos, se ve reducida por la presencia de mecanismos de resistencia tanto cromosómicos como plasmídicos. 3. Los mecanismos plasmídicos de resistencia a quinolonas, solos o en asociación con mecanismos cromosómicos, modifican el fitness bacteriano. 4. La sobreexpresión de los mecanismos plasmídicos de resistencia a quinolonas puede ejercer un efecto citotóxico sobre las células bacterianas. El objetivo general de este estudio se centra en el análisis del papel que los mecanismos plasmídicos de resistencia a quinolonas, en combinación con mecanismos cromosómicos, juegan en la aparición y desarrollo de resistencia a quinolonas, así como en la modificación del fitness bacteriano. Para desarrollar este objetivo en ausencia de otros factores que pudieran interferir se diseñará y contruirá una colección de cepas isogénicas de E. coli en la que se representen la mayoría de los mecanismos de resistencia a quinolonas comúnmente encontrado en aislados clínicos, contemplando aquellos de naturaleza tanto cromosómica como plasmídica. Los objetivos específicos que se propusieron en este trabajo fueron: 1. Análisis de la contribución de los mecanismos cromosómicos y plasmídicos de resistencia a quinolonas sobre la actividad de quinolonas y su impacto sobre el desarrollo de resistencia de nivel clínico. 2. Análisis de la contribución de los mecanismos cromosómicos y plasmídicos de resistencia a quinolonas sobre la producción de especies reactivas de oxigeno. 3. Determinar el efecto de los mecanismos cromosómicos y plasmídicos, tanto en combinaciones de bajo nivel de resistencia como resistentes a quinolonas, sobre el fitness bacteriano bajo diferentes condiciones de crecimiento 4. Análisis del posible efecto citotóxico causado por sobreexpresión de mecanismos plasmídicos sobre las células bacterianas. De los resultados obtenidos en los trabajos expuestos en este proyecto de Tesis Doctoral se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. En nuestras condiciones experimentales se observa una relación entre la combinación de mecanismos de resistencia a quinolonas, plasmídicos y cromosómicos, con la sensibilidad a las mismas, la categoría clínica derivada y el fitness bacteriano en E. coli. 2. La presencia de mecanismos plasmídicos de resistencia en cepas de E. coli con al menos dos mutaciones cromosómicas determina aumentos de la CMI de quinolonas por encima de los puntos de corte establecidos para cepas sensibles por las agencias internacionales. 3. La expresión de algunos mecanismos cromosómicos (deleción de marR) o plasmídicos (qnrD1 o qepA2) puede determinar en E. coli valores de CMI de fluoroquinolonas menores que los establecidos para el denominado punto de corte epidemiológico, por debajo del cual se presupone que no existen mecanismos de resistencia. 4. La acumulación de mecanismos de resistencia a quinolonas, cromosómicos y plasmídicos, disminuye la producción de especies reactivas de oxígeno, lo que se correlaciona con una pérdida de la actividad bactericida de las mismas. 5. En ausencia de mecanismos plasmídicos de resistencia a quinolonas, la presencia de mecanismos cromosómicos no disminuye el fitness bacteriano. Sin embargo, algunos mecanismos cromosómicos, solos o en combinación aumentan el fitness bacteriano. 6. El efecto de los genes qnr sobre el fitness bacteriano es variable. En nuestras condiciones experimentales, la presencia del gen qnrA1 reduce el fitness bacteriano y los genes qnrD1 y qnrS1 lo incrementan. 7. La adquisición del gen qepA2 tiene coste biológico en E. coli en presencia de un gen marR funcional, mientras que este coste biológico es compensado e incluso se convierte en una condición favorable para el crecimiento bacteriano en presencia de una deleción en este mismo gen. 8. La sobreexpresión de los genes qnr en E. coli tiene un efecto citotóxico. 9. La sobreexpresión del gen qepA2 en E. coli no tiene un efecto citotóxico.