Caracterización de los circuitos GDNF-GFRa1 en el sistema nervioso central: Función de SHH en el mantenimiento de las neuronas estriatales productoras de GDNF y de la vía nigroestriatal

Abstract

El factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) protege a las neuronas catecolaminérgicas frente a toxinas y, por tanto, ha sido muy estudiada su aplicación en el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson (EP). Ejerce una potente acción trófica sobre neuronas dopaminérgicas (DA) tanto in vivo como in vitro. En el sistema nervioso central (SNC) es producido mayoritariamente por neuronas y es necesario para el mantenimiento de las neuronas DA adultas mesencefálicas y otros núcleos del SNC y periférico. Para transmitir su señal al interior celular, GDNF homodimeriza e interacciona específicamente con GFRa1, un receptor anclado a membrana (Pascual et al. 2011). De forma general, GDNF promueve funciones de apoptosis y supervivencia celular, mantenimiento del fenotipo dopaminérgico, homeostasis redox e inhibe la producción de Sonic hedgehog (SHH) en las neuronas DAérgicas mesencefálicas (Gonzalez-Reyes et al. 2012). La función de GDNF en diferentes tejidos, así como su patrón de expresión, ha sido estudiado por diferentes técnicas entre las que cabe destacar el uso de animales modificados genéticamente (reporteros y knock/outs). Del mismo modo, GDNF ha mostrado su potencial terapéutico en diversos contextos, entre los que destacan el (1) sistema mesolímbico, (2), las motoneuronas y (3) los circuitos motores superiores. No obstante, a pesar de ser prometedoras, las terapias basadas en GDNF, presentan importantes inconvenientes derivados de la falta de conocimiento sobre la fisiología del factor como por ejemplo su acción sobre otros núcleos del SNC diferentes de la vía nigroestriatal y los mecanismos que regulan su expresión. Por esta razón, se propusieron los siguientes objetivos: 1. Caracterizar los circuitos GDNF-GFRa1 en el SNC. 2. Analizar la función de SHH en la homeostasis del circuito nigroestriatal, haciendo hincapié en su interacción con GDNF. Para llevar a cabo el primer objetivo se utilizaron animales modificados genéticamente que portaron alelos marcados Gfra1Flox; Gdnf Egfp y Gdnf LacZ. Mediante técnicas histológicas de observación simultánea de EGFP y LacZ se caracterizaron las áreas de expresión. Los animales mutantes se obtuvieron por cruce con los animales marcados –con alelos nulos-. Para la realización del segundo objetivo, se diseñaron diferentes líneas en las que el transductor obligatorio de SHH, Smoothened (Smo) se encuentra deplecionado en interneuronas PV+ o ChAT+. Por último, se utilizaron animales TH-SDHD (Diaz-Castro et al. 2012) para analizar el efecto de la depleción de la Sustancia negra completa durante la vida postnatal. Se utilizaron técnicas histológicas para determinar el estado de las poblaciones analizadas, técnicas de biología molecular para medir el nivel de expresión de marcadores y HPLC. Respecto al primer objetivo, la descripción de los circuitos tróficos GDNF-GFRa1 en el SNC, se caracterizaron nuevas interacciones de larga distancia entre la habénula medial-fascículo retroflexo-núcleo interpeduncular, donde se propuso la función de GDNF en la formación de sinapsis durante el desarrollo; así como entre las neuronas subiculares, cuerpos mamilares y tracto mamilotalámico, donde se propuso la función de GDNF como molécula de guía axonal. En ninguno de estos tractos se demostró que GDNF tuviera función clave para la formación de los mismos, puesto que mutantes con deficiencia total o parcial de la señalización no mostraron conexiones evidentemente aberrantes, aunque serían necesarios estudios con mayor resolución para refutar o confirmar esta hipótesis. Por otra parte, fueron identificadas interacciones locales entre neuronas productoras de ligando y receptor, como por ejemplo las encontradas en la sustancia innominada, tubérculo olfatorio o accumbens, entre otros. Por último, dentro de los núcleos reticulado del tálamo y núcleo trigeminal motor se encontraron neuronas que expresaron simultáneamente tanto GDNF como su receptor. Basándonos en estos resultados, proponemos una interacción autotrófica en estos núcleos no descrita hasta la fecha.

Respecto al segundo objetivo, la descripción de las función de la interacción SHH-GDNF en la vía nigroestriatal, los resultados mostraron una compleja red de interacciones de dependencia en el sistema entre las neuronas de proyección dopaminérgicas y poblaciones de interneuronas colinérgicas y parvalbúmina productoras de GDNF. En concreto, nuestros resultados mostraron que las PV+ no dependen de la señalización por SHH para su supervivencia o producción de GDNF, puesto que la ablación del transductor obligatorio de SHH, SMO específicamente en estas neuronas no produjo fenotipo degenerativo, aún demostrándose un satisfactorio nivel de recombinación. Por otra parte, las neuronas colinérgicas si demostraron depender de la señalización por SHH en animales de 10 meses de edad para su supervivencia. La degeneración de las interneuronas colinérgicas, además, conllevó la pérdida de neuronas de proyección dopaminérgicas mesencefálicas, así como el incremento en la síntesis de GDNF por parte de las neuronas PV+. Por último, analizamos el animal desarrollado por el grupo del Dr. López-Barneo (Diaz-Castro et al. 2012), TH-SDHD, carente de sustancia negra (SN) por un efecto postnatal tóxico de efecto mitocondrial. El análisis de animales envejecidos en los que las neuronas de la SNpc se hayan degeneradas muestra que la población PV+, productora de GDNF, depende para su supervivencia de la presencia de la SNpc. Por el contrario, las interneuronas colinérgicas resultaron ser independientes.