Estudios sobre la via de asimilación de amonio en cianobacterias glutamato sintasa y glutamina sintetasa de "Synechocococcus 6301"

Abstract

Nuestro trabajo se ha centrado en completar los conocimientos existentes sobre la vía de incorporación de amonio a esqueletos carbonados en cianobacterias. Por una parte hemos iniciado el estudio bioquímico de la glutamato sintasa de Synechococcus 6301 y por otra h ... emos avanzado en el conocimiento de la fisiología de la regulación de su glutamina sintetasa. Se ha purificado y caracterizado en Synechococcus 6301, cianobacterias unicelular no fijadora de nitrógeno, la Glutamato Sintasa, segunda enzima de la ruta de incorporación de amonio a esqueletos carbonados. Previamente se ha puesto a punto un método para el ensayo de su actividad que emplea HPLC. La enzima se purifica empleando como pasos determinantes precipitación fraccionada con etanol y cromatografía de afinidad en Ferredoxina-Sefarosa. Se obtiene una preparación de Glutamato Sintasa pura, con un rendimiento del 40% y una actividad específica de 30 unidades/mg proteína. La enzima consta de una única subunidad de 158 kDa, con un espectro de absorción característico de Flavoproteína. El grupo prostético Flavínico se ha identificado como una sola molécula de FMN. La enzima es estrictamente dependiente de Ferredoxina reducida como donador de electrones. Azaserina y DON, análogos de Glutamina, a concentraciones de 1 y 0,1 mM respectivamente inhiben totalmente la actividad. La incubación con 0,5 mm de PHMB produce una inhibición del 60%. Se ha estudiado igualmente la regulación por luz-oscuridad de la Glutamina Sintasa, primera enzima de la ruta. La enzima presenta altos niveles de actividad en células creciendo a la luz y con nitrato como fuente de nitrógeno, que caen a un 5% al pasar las células a oscuridad, con un t1/2 de 60 minutos. La bajada se debe a un fenómeno de inactivación y no a degradación proteica, recuperándose los niveles iniciales de actividad al reilumina|