Generación de una linea mutante CRISPR-Cas9 para el gen rx3y estudio del papel de Wnt2 y Wnt8b durante el desarollo del ojo en zebrafish.

Abstract

El scaling en la morfogénesis se refiere al proceso por el cual los tejidos y órganos mantienen proporciones y patrones invariantes a medida que crecen en tamaño. El ojo es una estructura muy conservada entre los vertebrados y estudiar su mecanismo de scaling tiene el potencial de generar un impacto significativo en varias disciplinas, abarcando desde una mejor comprensión de sistemas biológicos hasta la medicina regenerativa. Este trabajo cumple con el inicio de una investigación a mayor escala para estudiar y generar un modelo de scaling del ojo en zebrafish. Estudiamos el papel de los morfógenos Wnt2 y Wnt8b, los cuales se sospecha que cumplen una función en el scaling. Nos centramos además en la creación de la F0 de una línea mutante para el gen rx3 de zebrafish incapaz de desarrollar ojos con el fin de utilizarla en un escenario experimental. Los mutantes rx3 homocigotos mueren a las 2 semanas de vida no siendo viables para la generación de línea de interés. Se plantea, por tanto, la elección de los individuos heterocigotos portadores de la mutación para la creación de la línea. En el estudio de los morfógenos, nuestros resultados demostraron la implicación de Wnt8b y Wnt2 en la formación del ojo confirmando el papel del último en la diferenciación de la población celular de RPE. Además, con el fin de caracterizar con mayor exactitud propiedades biofísicas de Wnt2 y Wnt8b planteamos la generación de constructos de ADN codificantes para proteínas fusión Wnt-GFP. La creación del constructo Wnt8b-GFP resultó exitosa; sin embargo, su expresión no se da de forma adecuada probablemente debido a fallos en el plegamiento ante lo cual proponemos el uso de un linker distinto para la unión de los dominios Wnt y GFP.