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PhD Thesis

dc.contributor.advisorManzano Harriero, José Carloses
dc.contributor.advisorGarcía Guerrero, Migueles
dc.creatorCandau Chacón, Pedroes
dc.date.accessioned2014-11-27T11:58:43Z
dc.date.available2014-11-27T11:58:43Z
dc.date.issued1979es
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11441/15634
dc.description.abstractEl nitrógeno es uno de los elementos cualitativa y cuantitativamente más importantes de la materia viva, en la que se encuentra como componente de algunas de las biomoléculas más representativas, tales como proteínas y ácidos nucléicos. La vía de entrada del nitrógeno en los seres vivos es el Reino Vegetal, a través del cual llega a los animales en el estado de máxima reducción correspondiente al nitrógeno orgánico. También las plantas necesitan que el nitrógeno esté reducido al máximo para poder combinarlos con compuestos carbonados y formar así los distintos compuestos nitrogenados de sus células. Sin embargo, a diferencia de los animales, las plantas tienen la capacidad de utilizar el nitrógeno inorgánico existente en la Naturales, el cual reducen hasta amonio previamente a su incorporación. Con excepción de un pequeño grupo de organismos capaces de fijar el nitrógeno atmosférico, la forma nitrogenada más utilizada es el nitrato, de los que da ide el hecho de que se reduzcan anualmente unos 10.000 millones de toneladas de este compuesto (Beevers y Hageman, 1969; Losada, 1972). La utilización de nitrato como fuente nitrogenada no está restringida a ningún grupo de organismos, sino que es general, siendo realizada tanto por algas y plantas superiores, como por distintos géneros de hongos y bacterias. La diferencia existente entre los estados de reducción que presenta el nitrógeno en el nitrato, +5, y en el amonio, -3, implica la necesidad de una transferencia de 8 electrones que, como ha quedado firmemente establecido, ocurre en sólo dos etapas: a) reducción de nitrato a nitrito, catalizada por el enzima nitrato reductasa, y b) reducción de nitrito a amonio, mediada por la nitrito reductasa, en reacciones que implican 2 y 6 electrones respectivamente (Beevers y Hageman, 1969, 1972; Hewitt, 1975; Hewitt et al., 1976; Losada, 1976; Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979). La reducción de nitrato a nitrito está catalizada por una molibdoproteína, la nitrato reductasa, que ha sido estudiada exhaustivamente en los últimos años. El enzima de organismos eucarióticos se ha clasificado como NAD(P)H-nitrato reductasa, atendiendo a la naturaleza de su donador fisiológico de electrones, los piridín nucleótidos reducidos. La nitrato reductasa de eucariotas fotosintéticos muestra una preferencia por NADH como donador de electrones, habiendo sido purificado a homogeneidad recientemente en el alga verde Chlorella vulgaris. En la NADH-nitrato reductasa de este alga se ha determinado la existencia de tres subunidades de 95-100 KD como constituyentes de un enzima de 356 KD de peso molecular, que contiene como grupos prostéticos 2 moléculas de FAD, dos grupos hemo del tipo b, y 2 átomos de molibdeno (Solomonson et al., 1975). La situación en hongos, es similar, a excepción de la preferencia del enzima por NADPH, encontrándose también FAD, hemo b, y molibdeno en la molécula, si bien son solo dos las subunidades presentes (115 KD cada una) siendo, consecuentemente, su peso molecular (230 KD) inferior al de eucariotas fotosintéticos (Garret y Nason, 1969; Pan y Nason, 1979). En eucariotas, la transferencia de los electrones al nitrato está mediada por dos actividades enzimáticas que operan secuencialmente y que, aunque no se han logrado separar físicamente, pueden ser ensayadas independientemente y se afectan de forma específica por distintos inhibidores y tratamientos. La primera de estas actividades es una NAD(P)H-diaforsa, que contiene FAD y que por ser la captadora de electrones es la que marca la especificidad por NADH ó NADPH en cada caso. La segunda actividad del complejo enzimático NAD(P)H-nitrato reductasa es la nitrato reductasa terminal, también denominada FNH2-nitrato reductasa, por su capacidad de utilizar flavín-nucleótidos (o viológenos) reducidos, como donadores de electrones. Estudios fisicoquímicos y enzimáticos de diversa índole han determinado que el molibdeno está implicado en esta segunda actividad, pensándose que este metal interacciona directamente con el nitrato. El papel de los grupos hemo, así como su participación en una u otra actividad, permanece aún si aclarar definitivamente (Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979). A diferencia de lo que ocurre con la nitrato reductasa de eucariotas, que se considera soluble, en organismos procarióticos el enzima se encuentra, en general, unido a membranas de tipo fotosintético o respiratorio. En estos organismos parece no existir una actividad diaforásica similar a la del enzima de eucariotas, encontrándose que los piridín nucleótidos reducidos no se comportan como donadores de electrones adecuados para estos enzimas, si bien se han descrito casos en los que se observaba reducción de nitrato con NADH en preparaciones de membranas de bacterias fotosintéticas y cianobacterias (Hattori y Myers, 1967; Hattori, 1970; Katoh, 1963). La ferredoxina, una proteína sulfoférrica de potencias muy negativo, es el principal candidato para desempeñar el papel de donador de electrones fisiológico de la nitrato reductasa de procariotas, habiendo sido descrita su participación en la reducción de nitrato en algunos organismos tanto fotoergónicos como quimioergónicos. En procariotas fotosintéticos, cianobacterias y bacterias fotosintéticas, la ferredoxina reducida por el fotosistema I podría ser el donador fisiológico de electrones para el enzima, si bien en bacterias no fotosintéticas la baja actividad de reducción observada con ferredoxina y la necesidad de utilizar sistemas exógenos para reducirla, dejan abierto a discusión su posible papel como donador fisiológico (Losada y Guerrero, 1979). En la actualidad, la única nitrato reductasa de procariotas que se ha conseguido purificar hasta un nivel aceptable (95% de pureza) ha sido la de la bacteria fotosintética Rhodopseudomonas capsulata, encontrándose, tras una purificación de solo 60 veces, que la proteína, de peso molecular 185 KD, tiene dos subunidades iguales de 85 KD cada una, no presenta FAD y sí un átomo de molibdeno y 1 ó 2 grupos de hemo c por molécula (ALef y Klemme, 1977, 1979). El enzima no acepta electrones de los piridín nucleótidos reducidos, siendo su donador fisiológico desconocido por el momento. La baja actividad específica (menos de 1 U/mg proteína), así como el hecho de que preparaciones menos purificadas tuviesen actividades específicas superiores, es explicado por estos autores como la consecuencia de una destrucción parcial del enzima durante la purificación (Alef y Klemme, 1979). Esto significa que aún cuando el enzima esté purificado, el conocimiento que de él se tiene es escaso y además basado en un enzima de cuya integridad se duda. El segundo enzima de la ruta de reducción de nitrato, la nitrito reductasa, ha sido identificado en eucariotas fotosintéticos como una ferroproteína de 63 KD de peso molecular que carece de FAD y contiene un grupo sirohemo y un centro sulfoférrico del tipo {Fe4-S4*} (Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979; Cárdenas et al., 1979; Lancaster et al., 1979). A diferencia de la nitrito reductasa de hongos, que contiene FAD que acepta electrones de los piridín nucleótidos reducidos, la nitrito reductasa de algas verdes y plantas superiores, utiliza la ferredoxina reducida fotosintéticamente como donador de electrones (Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979; Cárdenas et al., 1979), al igual que se ha encontrado para nitrito reductasa de cianobacterias (Manzano et al., 1976; Manzano, 1977; Méndez, 1979). Las cianobacterias (alga verde-azuladas) constituyen un grupo perfectamente delimitado de microorganismos cuya presencia sobre la Tierra data de al menos 2.800 millones de años (Schopf, 1970). La singularidad de este grupo reside en unir a una estructura celular procariótica, un aparato fotosintético capaz de utilizar el agua como donador de de electrones, lo que le confiere una situación de puente entre las bacterias y las plantas superiores, de indudable interés evolutivo, y biológico en general (Fogg et al., 1973; Stanier y Cohen-Bazire, 1977). De igual forma que otros organismos fototrofos, las cianobacterias asimilan compuestos de nitrógeno inorgánico tales como nitrato, nitrito o amonio (Allen y Arnon, 1955), presentando algunas de ellas la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (Fogg et al., 1973). La importancia cuantitativa de la asimilación del nitrógeno inorgánico por estos organismos puede resaltarse señalando que el nitrógeno constituye del 4 al 9% del peso seco de las células. En contraposición con el sistema reductor de nitrato de plantas superiores, algas y hongos, la información existente sobre el proceso de reducción de nitrato en cianobacterias es bastante escasa, aunque se ha demostrado que la reducción transcurre vía nitrito en dos reacciones enzimáticas consecutivas (Hattori, 1962; Manzano et al., 1976, Manzano, 1977). La nitrato reductasa de estos organismos se encuentra unida a membranas, pudiendo ser solubilizada por diversos procedimientos obteniéndose un enzima que es activo con donadores artificiales pero que no puede aceptar electrones de los piridín nucleótidos (Hattori Myers, 1966, 1967; Hattori, 1970; Hattori y Uesugi, 1968a; Manzano et al., 1976). Preparaciones particuladas de Anabaena cylindrica catalizan la reducción de nitrato con ferredoxina como donador cuando se preparan empleando ultrasonidos, mientras que si se utilizan acetona para ello es el NADH y no la ferredoxina el donador de electrones efectivo encontrado (Hattori Myers, 1967). Cuando el enzima se solubiliza, solo los flavín nucleótidos, o los viológenos, reducidos sirven como donadores de electrones (Hattori, 1970). Sistemas reconstruidos de Anabaena cylindrica, empleando el sistema ascorbat/DPIP como donador de electrones del fotosistema I, llevan a cabo la reducción de nitrato y nitrito dependiente de ferredoxina (Hattori Uesugi, 1968b). En Anacystis nidulans y Nostoc muscorum se ha descrito la reducción fotosintética de nitrato por preparaciones de membranas que llevaban asociadas la actividad nitrato reductasa (Manzano et al., 1976; Ortega et al., 1976). La ferredoxina parece ser el transportador de electrones entre el fotosistema I y el enzima, si bien en su ausencia aún tenía lugar una apreciable reducción de nitrato. Utilizando enzima soluble de A. nidulans ligeramente purificado se ha comprobado que la ferredoxina reducida por el sistema NADPH/NADP reductasa de espinacas, era capaz de donar electrones a la nitrato reductasa (Manzano et al., 1976; Manzano, 1977). La reducción de nitrato en cianobacterias es un proceso íntimamente ligado a la fotosíntesis, habiéndose conseguido acoplar en preparaciones de membranas de A. nidulans, el poder reductor generado a partir del agua por el aparato fotosintético a la reducción de nitrato a amonio, con desprendiendo estequiométrico de oxígeno (Candau et al., 1976). En el presente trabajo se presentan evidencias aclaratorias de algunos puntos conflictivos sobre la reducción de nitrato en cianobacterias y se aportan otras nuevas relativas a la participación de la ferredoxina como donador inmediato de electrones para la nitrato reductasa de A. nidulans. Se ha desarrollado un procedimiento general de purificación de enzimas dependientes de ferredoxina, por cromatografía de afinidad redox en geles de ferredoxina-Sefarosa, que se ha aplicado con éxito a la purificación hasta homogeneidad de NADP reductasa y nitrato reductasa de A. nidulans, habiéndose estudiado en especial algunas de las propiedades de este último enzima.es
dc.formatapplication/pdfes
dc.language.isospaes
dc.rightsAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 España
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subjectAnacystis nidulanses
dc.subjectCianobacteriases
dc.titlePurificación y propiedades de la ferredoxina-nitrato reductasa de la cianobacteria "Anacystis nidulans"es
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesises
dcterms.identifierhttps://ror.org/03yxnpp24
dc.rights.accessrightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.contributor.affiliationUniversidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Moleculares
idus.format.extent201 p.es
dc.identifier.idushttps://idus.us.es/xmlui/handle/11441/15634

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