Producción de carotenoides por microalgas y caracterización de la ruta carotenogénica en chlorella zofingiensis

Abstract

Las microalgas son una de las principales fuentes naturales de carotenoides de interés comercial, sin embargo su productividad no es siempre tan alta como se requeriría para que sea económicamente rentable. Para superar esta limitación es esencial seleccionar las estirpes más adecuadas para la producción, identificar las condiciones que conducen a las máximas productividades, obtener mutantes super-productores mediante mutagénesis clásica o Ingeniería Genética en las estirpes seleccionadas, y estudiar la ruta carotenogénica y su regulación.

En el primer capítulo de esta Tesis se ha realizado un estudio de 13 microalgas clorofíceas y se ha seleccionado Chlorella sorokiniana para la producción de luteína, ya que presentaba un alto contenido en este carotenoide (24 mg L-1) y la más alta velocidad de crecimiento (0,12 h-1). En esta microalga se ha estudiado el efecto de varios factores nutricionales y ambientales sobre el crecimiento y acumulación de luteína, con el fin de optimizar la producción de dicho carotenoide. Los resultados obtenidos indican que, en general, las condiciones óptimas para el crecimiento también conducen a la máxima productividad de luteína. La mayor velocidad específica de crecimiento y el máximo contenido en luteína (35,0 mg L-1 y 5,2 mg g-1 de peso seco) se alcanzaron a 690 μmoles de fotones m-2 s-1, 28 ºC, 2 mM de NaCl, 40 mM de nitrato y bajo condiciones mixotróficas con 40 mM de acetato y 100 mM de glucosa. Por otro lado, se han obtenido mutantes de C. sorokiniana super-productores de luteína mediante mutagénesis al azar y selección de los mutantes por su resistencia a inhibidores de la ruta carotenogénica, además de por su alta velocidad de crecimiento y alto contenido en luteína. Así, el mutante MR-16 mostró un contenido volumétrico en luteína 2 veces mayor que el de la estirpe silvestre, alcanzándose valores de 42 mg L-1 y los mutantes DMR-5 y DMR-8 presentaron un contenido celular en luteína de 7 mg g-1 de peso seco. Estos valores son superiores a los descritos para otras microalgas productoras de luteína bajo condiciones fotoautotróficas a escala de laboratorio. Por tanto, C. sorokiniana es una excelente candidata para la producción de este pigmento de gran interés comercial.

En el segundo capítulo de esta Tesis se ha llevado a cabo el aislamiento y caracterización del gen de la fitoeno sintasa de Chlorella zofingiensis (Czpsy), implicada en el primer paso de la ruta biosintética de los carotenoides. La funcionalidad del gen Czpsy se ha comprobado por complementación genética heteróloga en E. coli y el análisis por Southern blot ha revelado que C. zofingiensis contiene una única copia del gen Czpsy. Este gen recién aislado codifica una proteína de 420 aminoácidos que contiene un dominio transmembrana de 20 aminoácidos y una secuencia señal para su exportación al cloroplasto, situada en el extremo amino terminal. Además, el análisis filogenético ha mostrado que la fitoeno sintasa de C. zofingiensis está muy relacionada evolutivamente con las fitoeno sintasas de plantas y microalgas. Por otro lado, el gen Czpsy fue insertado adecuadamente en un vector y expresado constitutivamente bajo el control de los promotores fuertes rbsS2, de la subunidad pequeña de la RuBisco, y hsp70A, de la proteína de choque térmico, en la microalga Chlamydomonas reinhardtii. Su sobreexpresión por transformación nuclear permitió un incremento en los niveles de transcrito de la fitoeno sintasa y un incremento en el contenido de los carotenoides violaxantina y luteína, que alcanzaron niveles 2,0 y 2,2 veces mayores, respectivamente que los de las células no transformadas. Además, no se observó fenotipo atípico en los transformantes y sus tasas de crecimiento eran similares a la de la estirpe silvestre. Estos resultados suponen uno de los pocos ejemplos descritos de manipulación genética estable de la ruta carotenogénica en microalgas y abren la posibilidad de aumentar la productividad de carotenoides de interés comercial por Ingeniería Genética.

En los capítulos tercero y cuarto de esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el aislamiento y caracterización de los genes de la licopeno β-ciclasa (CzlcyB) y de la licopeno ε-ciclasa (CzlcyE) de C. zofingiensis, implicados en la formación de carotenoides con anillos β y ε. El análisis por Southern blot ha sugerido la presencia de una única copia de estos genes en el genoma de C. zofingiensis. El gen CzlcyB codifica una proteína de 546 aminoácidos que contiene dos dominios transmembrana de 21 aminoácidos cada uno en el extremo carboxilo terminal. El análisis funcional por complementación heteróloga en E. coli mostró que esta proteína cataliza la ciclación del licopeno y del δ-caroteno para producir β- y α-caroteno, respectivamente, al igual que las LCYb de plantas y microalgas estudiadas. El gen CzlcyE codifica una proteína de 654 aminoácidos que contiene cinco dominios transmembrana de 20 aminoácidos cada uno distribuidos uniformemente en la proteína y una secuencia señal para la exportación al cloroplasto, localizada en el extremo amino terminal. Mediante complementación genética en E. coli se ha comprobado la funcionalidad del gen CzlcyE y se ha determinado que la proteína codificada por dicho gen cataliza la conversión de licopeno en δ-caroteno, pero no la formación de α-caroteno a partir de δ-caroteno, presentando, por tanto, actividad monociclasa como la mayoría de las LCYe de plantas y la de la microalga verde Auxenochlorella protothecoides.

Por otro lado, se ha estudiado la regulación por luz y nitrógeno de la ruta carotenogénica en C. zofingiensis, determinando los niveles de mRNA de los genes psy, lcyB, lcyE, pds, chyB y bkt, así como los contenidos celulares en α-caroteno y su producto luteína, y en β-caroteno y sus derivados cantaxantina, astaxantina, zeaxantina y violaxantina. El estrés por alta irradiancia no incrementó los niveles de mRNA de los genes lcyB y lcyE en comparación con los niveles registrados en condiciones de baja irradiancia, mientras que los niveles de transcritos de los demás genes estudiados aumentaron significativamente; activando, sin embargo, la síntesis de los carotenoides secundarios astaxantina, cantaxantina y zeaxantina y disminuyendo los niveles de los carotenoides primarios α- y β-caroteno, violaxantina y luteína. El estrés por deficiencia de nitrógeno per se aumentó los niveles de mRNA de todos los genes estudiados, excepto los de los genes lcyE y pds, sin embargo no desencadenó la síntesis de cantaxantina, zeaxantina ni astaxantina. No obstante, la combinación de ambos factores de estrés, alta irradiancia y deficiencia de nitrógeno, incrementó significativamente los niveles de estos carotenoides, así como los niveles de los transcritos del gen bkt, en comparación con los registrados en los cultivos sometidos únicamente a estrés de alta irradiancia.