Estudio del papel de CSPa/DNAJC5 en la función y mantenimiento de las sinapsis glutamatérgicas del hipocampo en ratones adultos

Abstract

La cochaperona sináptica Cysteine String Protein CSP /DNAJC5) se ha implicado en la patogénesis de enfermedades neurodegenerativas como la lipofuscinosis neuronal ceroidea autosómica dominante del adulto (enfermedad de Kufs/CLN4) y las enfermedades de Parkinson y Alzheimer. Se ha demostrado que la proteína CSP /DNAJC5 actúa como cochaperona para mantener la estabilidad de la proteína SNARE SNAP25. Esta cochaperona es esencial para el mantenimiento de sinapsis que operan en un régimen de alta actividad, pero los mecanismos moleculares de su acción protectora no están aún bien establecidos. Por otro lado, el funcionamiento de las sinapsis glutamatérgicas del hipocampo que operan a baja actividad es crucial en los fenómenos de aprendizaje y memoria y en las alteraciones cognitivas asociadas a la neurodegeneración, no obstante, el papel que la CSP /DNAJC5 juega en estas sinapsis es desconocido. En esta tesis doctoral se han empleado ratones knockout (KO) convencionales carentes de CSP /DNAJC5 (ratones Dnajc5 KO) y se han generado y validado nuevos ratones KO condicionales inducibles por tamoxifeno (TMX) carentes de CSP /DNAJC5 (ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ ) y carentes de la proteína SNARE SNAP25 (CaMKII creERT2:Ai27D:Snap25flox/flox) específicamente en neuronas glutamatérgicas del prosencéfalo para el estudio de las sinapsis glutamatérgicas que forman las neuronas hipocampales. En los ratones Dnajc5 KO, la liberación de glutamato evocada por potenciales de acción, la plasticidad a corto plazo, así como la frecuencia de liberación espontánea no presentaron mayores alteraciones en las sinapsis entre las colaterales de Schaffer y las neuronas piramidales de la región CA1 (sinapsis SC CA1). No obstante, la amplitud de las corrientes miniaturas (mEPSCs) resultó estar disminuida, lo que podría deberse a plasticidad homeostática secundaria a un déficit en la transmisión GABAérgica. Curiosamente, en estos ratones, se observó una disminución de los niveles de la proteína SNARE SNAP25 solamente en las sinapsis SC CA1 pero no en las sinapsis formadas entre fibras musgosas de las células granulares y las MF CA3. La investigación de mecanismos autónomo celulares de la cochaperona CSP /DNAJC5 en las sinapsis glutamatérgicas se llevó a cabo en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ que resultaron ser viables, sin presentar fenotipos neurológicos ni conductuales evidentes a edades tempranas, pero que experimentaron un mayor deterioro y mortalidad que los ratones controles a partir de los 12 meses de edad (10 meses post TMX). La liberación de glutamato evocada por potenciales de acción y la plasticidad a corto plazo resultó ser prácticamente normal en las sinapsis SC A1 en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ pero la frecuencia de liberación espontánea y la carga de las corrientes miniaturas (mEPSCs) aparecieron aumentadas. Este fenotipo no se pudo explicar por un cambio estructural en la morfología o en el número de las espinas dendríticas que resultaron ser normales. Curiosamente, se ha descrito un fenotipo similar inducido por la mutación L50S en SNAP25 que causa encefalopatía epiléptica infantil en humanos. Por otro lado, la liberación espontánea de glutamato en las sinapsis MF CA3 resultó ser normal en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ . Análogamente a lo observado en los ratones Dnajc5 KO, en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ los niveles de la proteína SNARE SNAP25 aparecieron disminuidos en las sinapsis SC CA1 siendo normales en las sinapsis MF CA3. Esto indica que la cochaperona CSP /DNAJC5 es esencial para mantener, mediante un mecanismo postraduccional y autónomo celular, los niveles de SNAP25 en la sinapsis SC CA1 pero no en la sinapsis MF CA3. Las diferencias en la proteostasis de SNAP25 entre las sinapsis SC CA1 y MF CA3 podrían explicar las diferencias en el patrón de liberación espontánea de glutamato entre ambas sinapsis en ausencia de CSP /DNAJC5. Con objeto de investigar el papel de SNAP25 en los fenotipos observados, se estudiaron los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Snap25flox/flox que presentaron un fenotipo de letalidad temprana a las dos semanas de administrar dieta con tamoxifeno. En las sinapsis SC CA1 de los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Snap25flox/flox, la frecuencia de liberación espontánea de glutamato resultó estar disminuida y el tiempo de subida y el decaimiento de las corrientes miniaturas mEPSCs aparecieron enlentecidos. Estos fenotipos podrían deberse a defectos en la formación del complejo SNARE y en la cinética de apertura del poro de fusión. Sorprendentemente, en estas mismas sinapsis la liberación de glutamato evocada por potenciales de acción aumentó. Este fenotipo inesperado podría deberse a la participación compensatoria de otra proteína de la familia de SNAP25 y a una mayor apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje, ya que se ha descrito previamente que SNAP25 bloquea este tipo de canales. En cualquier caso, el fenotipo en la liberación de glutamato observado en las sinapsis SC CA1 de los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ no puede explicarse por una mera disminución en los niveles de SNAP25 en esas sinapsis, pero podría deberse a la existencia de especies de SNAP25 con una conformación mal plegada y aberrante por la falta de la actividad de la cochaperona CSP /DNAJC5, ejerciendo un efecto patológico análogo al observado en la mutación L50S en SNAP25 que causa encefalopatía epiléptica infantil en humanos. Las observaciones realizadas en esta tesis indican que las sinapsis glutamatérgicas del hipocampo son más resilientes a la falta de CSP /DNAJC5 que otras sinapsis centrales como el cáliz de Held o las sinapsis GABAérgicas que expresan parvalbúmina y que operan bajo un régimen de mayor actividad. No obstante, el aumento de la mortalidad a edades avanzadas de los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ pone de manifiesto un posible papel protector de CSP /DNAJC5 durante el envejecimiento necesario también para el mantenimiento de sinapsis que operan en régimen de baja actividad. Nuestras observaciones abren nuevas perspectivas en los mecanismos por los que las sinapsis mantienen su integridad funcional a lo largo de toda la vida. Por otro lado, hemos observado que las neuronas piramidales de la región CA3 de ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ a los 8, 16 y 22 meses después de finalizar la administración de dieta con tamoxifeno, no presentan la lipofuscinosis característica de la lipofuscinosis neuronal ceroidea autosómica dominante del adulto. Esto indica que la falta de función de CSP /DNAJC5 no causa la lipofuscinosis patológica propia de esta enfermedad humana, respondiendo a una pregunta hasta ahora abierta en el campo de la fisiopatología molecular de las lipofuscinosis.

The synaptic cochaperone Cysteine String Protein α (CSPα/DNAJC5) has been implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases such as autosomal dominant adult‐onset neuronal ceroid lipofuscinosis (Kufs disease/CLN4), Parkinson's disease, and Alzheimer's disease. It has been demonstrated that CSPα/DNAJC5 acts as a cochaperone to maintain the stability of the SNARE protein SNAP25. This cochaperone is essential for the maintenance of synapses operating under high activity conditions, but the molecular mechanisms of its protective action are not yet well established. On the other hand, the hippocampal glutamatergic synapses operating under low activity conditions play a crucial role in learning and memory as well as in cognitive impairments associated with neurodegeneration. However, the role of CSPα/DNAJC5 in these synapses is unknown. In this doctoral thesis, conventional knockout (KO) mice lacking CSPα/DNAJC5 (Dnja5 KO mice) were used, and new tamoxifen (TMX)‐inducible conditional KO mice lacking CSPα/DNAJC5 (CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐) and lacking the SNARE protein SNAP25 (CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox) specifically in forebrain glutamatergic neurons were generated and validated for the study of glutamatergic synapses formed by hippocampal neurons. In Dnajc5 KO mice, glutamate release evoked by action potentials, short‐term plasticity, and the frequency of spontaneous release, monitored at the synapses between the Schaffer collaterals and CA1 pyramidal neurons (SC‐CA1 synapses), did not show significant alterations. However, the amplitude of miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) was found to be reduced, which could be due to homeostatic plasticity secondary to a deficit in GABAergic transmission. Interestingly, a decrease in SNAP25 protein levels was observed only in the SC‐CA1 synapses but not in the synapses formed between mossy fibers of granule cells and pyramidal neurons from the CA3 region (MF‐CA3). The investigation of autonomous cellular mechanisms of the cochaperone CSPα/DNAJC5 in glutamatergic synapses was carried out in CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ mice, which were viable and did not show any evident neurological or behavioral phenotypes at early ages but experienced increased deterioration and mortality compared to control mice starting at 12 months of age (10 months post‐TMX). Glutamate release evoked by action potentials and short‐term plasticity was found to be nearly normal in SC‐A1 synapses in CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ mice, but spontaneous release frequency and the charge of mEPSCs appeared to be increased. This phenotype could not be explained by structural changes in the morphology or number of dendritic spines, which were found to be normal. Interestingly, a similar phenotype induced by the L50S mutation in SNAP25, which causes infantile epileptic encephalopathy in humans, has been described in these mice. On the other hand, spontaneous glutamate release in MF‐CA3 synapses was found to be normal in CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ mice. Similarly to what was observed in Dnajc5 KO mice, the levels of the SNARE protein SNAP25 were found to be decreased in SC‐CA1 synapses in CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ mice, while they remained normal in MF‐CA3 synapses. This indicates that the cochaperone CSPα/DNAJC5 is essential for maintaining SNAP25 levels in SC‐CA1 synapses, but not in MF‐CA3 synapses, through a posttranslational and cell‐autonomous mechanism. Differences in SNAP25 proteostasis between SC‐CA1 and MF‐CA3 synapses could explain the differences in spontaneous glutamate release patterns between these synapses in the absence of CSPα/DNAJC5. To investigate the role of SNAP25 in the observed phenotypes, mice with CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox were studied, and they exhibited early lethality phenotype two weeks after administration of a tamoxifen‐enriched diet. In SC‐CA1 synapses of CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Snap25flox/flox mice, the frequency of spontaneous glutamate release was decreased, and the rise and decay times of miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) were slowed down. These phenotypes could be attributed to defects in the formation of the SNARE complex and the kinetics of fusion pore opening. Surprisingly, in these same synapses, glutamate release evoked by action potentials increased. This unexpected phenotype could be due to compensatory involvement of another protein from the SNAP25 family and increased opening of voltage‐dependent Ca2+ channels, since it has been previously described that SNAP25 blocks this type of channels. In any case, the phenotype observed in glutamate release in SC‐CA1 synapses of CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ mice cannot be explained solely by a decrease in SNAP25 levels in those synapses, but it could be attributed to the presence of SNAP25 species with misfolded and aberrant conformation due to the lack of CSPα/DNAJC5 activity, exerting a pathological effect similar to that observed in the L50S mutation in SNAP25, which causes infantile epileptic encephalopathy in humans. The observations made in this doctoral thesis indicate that hippocampal glutamatergic synapses are more resilient to the lack of CSPα/DNAJC5 compared to other central synapses such as the calyx of Held or parvalbumin‐expressing GABAergic synapses, which operate under a higher activity regime. However, the increased mortality at advanced ages in CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ mice highlights a possible protective role of CSPα/DNAJC5 during aging, which would be also necessary for the maintenance of synapses operating under low‐activity conditions. Our observations open new perspectives on the mechanisms by which synapses maintain their functional integrity throughout life. On the other hand, we have observed that pyramidal neurons in the CA3 region of CaMKIIαcreERT2:Ai27D:Dnajc5flox/‐ mice at 8, 16, and 22 months after the cessation of tamoxifen diet administration do not exhibit the characteristic lipofuscinosis of autosomal‐dominant adult neuronal ceroid lipofuscinosis. This indicates that the lack of CSPα/DNAJC5 function does not cause the pathological lipofuscinosis associated with this human disease, answering a previously open question in the field of the molecular pathophysiology of lipofuscinosis.