Remodelado de la entrada de calcio en la angiogénesis: papel de las proteínas ORAI1 Y SARAF

Abstract

La angiogénesis se define como el proceso llevado a cabo por las células endoteliales (CE) por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes. Su regulación es precisa y está controlada por factores pro-angiogénicos, como el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). VEGF activa diferentes rutas de señalización que promueven el incremento de las concentraciones de calcio intracelular ([Ca2+]i). Estudios recientes sugieren que el cambio de [Ca2+]i regulado por SOCE, del inglés store-operated calcium entry, tiene un papel fundamental en el proceso de angiogénesis. Sin embargo, siguen siendo escasos los conocimientos sobre el papel que desempeñan en este proceso sus proteínas claves, entre ellas, SARAF, el emergente factor regulador de SOCE, y Orai1, la subunidad formadora del poro de los canales de SOCE. En este estudio demostramos que la inhibición de SOCE usando GSK-7975A (GSK), bloquea el crecimiento de los brotes a partir de anillos de aorta de rata cultivados ex vivo, la migración y la formación de tubos de CE humanas derivadas de la vena umbilical (HUVEC); y afecta significativamente al desarrollo de los vasos de la retina de ratón neonato. Encontramos que Orai1 y SARAF colocalizan en HUVEC y están implicados en el incremento de la [Ca2+]i mediada por VEGF. En esta misma línea, encontramos que la supresión de la expresión de ambas proteínas, usando siARNs, reduce significativamente la formación de tubos, la proliferación y la migración de las HUVEC. Por otra parte, motivados por estudiar la angiogénesis desde un punto de vista traslacional, demostramos que el suero de pacientes que han padecido un infarto severo del corazón con con elevación del segmento ST (STEMI) contiene elevados niveles de VEGF-A e interleuquina 17 A (IL-17A). Además, demostramos que el suero isquémico promueve la formación de tubos y la migración de las HUVEC, así como la atracción de las células tip en cultivo 3D de HUVEC. Igualmente, usando tapsigargina como estímulo de vaciado de reservorios, observamos una exacerbación de SOCE en células tratadas con suero isquémico que se correlacionó con un aumento en la expresión proteica de Orai1. Finalmente, en presencia de suero isquémico, evidenciamos que la inhibición de Orai1 previene la activación de MEF-2A, la migración de las células tip y la expresión de Notch1, Hes1, Hey1 y VEGF-A en HUVEC. Estos hallazgos se corroboraron utilizando suero de ratas sometidas a isquemia/reperfusión (I/R). Nuestros resultados muestran por primera vez la interacción funcional entre SARAF y Orai1 en las CE, remarcan el rol de las proteínas en el proceso de angiogénesis, y relacionan a Orai1 y SOCE con el proceso de angiogénesis post-isquémica.

Angiogenesis is the process which is controlled by endothelial cells (EC) to form new blood vessels from preexisting vascular beds. This process is tightly regulated by pro-angiogenic factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF), which promote signaling pathways involving an increase in the intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i). Recent studies suggest that store-operated calcium entry (SOCE) might play a role in angiogenesis. However, little is known regarding the role of SOCE proteins, such as SARAF, the SOCE-associated regulatory factor, and Orai1, the pore-forming subunit of the store-operated calcium channel (SOCC), in this process. In the present study, we demonstrate that SOCE inhibition using GSK-7975A (GSK) blocks ex vivo rat aorta sprouting, as well as human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) tube formation and migration. Likewise, the intraperitoneal injection of GSK drastically affects the development of mice retinal vasculature. Moreover, we find that Orai1 and SARAF colocalize in HUVEC and both are involved in VEGF-mediated [Ca2+]i. We also show that Orai1 and SARAF knockdown, using siRNA, impairs HUVEC tube formation, proliferation, and migration. Furthermore, in order to study angiogenesis from a translational perspective, we demonstrated that serum from patients with ST segment elevation myocardial infarction (STEMI) show high levels of VEGF and interleukin 17A (IL-17A). In the same vein, we find that ischemic serum promotes HUVEC tube formation and migration, as well as, tip cells attraction in 3D cell culture of HUVEC. Using thapsigargin to stimulate endoplasmic reticulum (RE) emptying, we observed an exacerbation of SOCE in HUVEC treated with ischemic serum which correlated with Orai1 overexpression. Finally, adding ischemic serum, we demonstrate that Orai1 knockdown prevents MEF-2A activation, tip cells migration and the expression of Notch1, Hes1, Hey1 and VEGF-A in HUVEC. These findings were confirmed using serum from rats after heart ischemia/reperfusion (I/R). Our data show for the first time a functional interaction between SARAF and Orai1 in EC and highlight their essential role in different processes of angiogenesis. In addition, we provided first evidence Orai1 function in angiogenesis induced by myocardial infarction.