Role of FLIP and REDD1 in the control of tumor cell fate under endoplasmic reticulum stress

Abstract

During tumor progression, cancer cells face different stress situations as a result of their uncontrolled growth and the action of the tumor microenvironment. The shortage of nutrients, like glucose or glutamine, and hypoxia develop and are accentuated with tumor growth, since the exchange of nutrients and oxygen as well as the elimination of cellular waste in deeper areas of the tumor are greatly compromised. All these events occur as a consequence of absent or disorganized vascularization, insufficient to meet the increased metabolic demands of the transformed cells. Both the lower availability of nutrients as well as reduced oxygen supply hamper the correct folding of proteins in the endoplasmic reticulum (ER), due to the malfunction of the enzymes involved in this process or the lack of post-translational modifications in newly synthetized proteins. In addition, the higher tumor proliferative rate entails a greater demand for protein synthesis in the ER. Together, all these alterations in tumor cells promote the build-up of misfolded proteins in the ER, leading to a situation known as ER stress. As a response to ER stress, both normal and transformed cells launch a set of signaling pathways known as the unfolded protein response (UPR), a complex signal transduction pathway that is initiated by the activation of at least three ER stress sensors: inositolrequiring protein 1 (IRE1), protein kinase RNA-like ER kinase (PERK) and activating transcription factor 6 (ATF6), with the aim of restoring ER proteostasis to maintain cell viability and function. In the adaptive phase of the UPR, general protein synthesis decreases, although the synthesis of certain proteins such as those related to folding (e.g. foldases and chaperones) and autophagy, as well as components of ER associated degradation pathway (ERAD) is favored, all of which serves to alleviate the loading of proteins in the ER. However, under prolonged or irreversible ER stress, the UPR activates mechanisms that lead to apoptotic cell death (terminal phase of the UPR), which may involve the intrinsic pathway, the extrinsic pathway, or both, depending on the cell type. Specifically, in the colorectal carcinoma cell line HCT116, the main cell model used in this thesis, the induction of the apoptotic program following intense and prolonged ER stress occurs through the PERK-ATF4-CHOP pathway. This ultimately leads to increased levels of the TRAIL receptor TRAILR2/DR5, specifically in the ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC). Clustering of the TRAILR2/DR5 receptors in this compartment lead to the assembly of the death-inducing signaling complex (DISC), which results in the processing and consequent activation of caspase-8 (i.e. the initiator of the apoptotic process). Active caspase-8 can, in turn, proteolytically activate effector caspases-3 and 7 and, at the same time, initiate the intrinsic pathway of apoptosis through the cleaving of the BH3-only protein BID, amplifying the activation of effector caspases, responsible for the dismantling of the cell. Interestingly, TRAILR2/DR5 clustering and subsequent DISC assembly occurs independently of its canonical ligand TRAIL, with the same unfolded or misfolded proteins acting as ligands through certain exposed hydrophobic regions in these proteins. Despite the established relationship between ER stress and the extrinsic pathway of apoptosis, the role of FLIPL/S, key proteins in controlling caspase-8 activation in the TRAIL DISC, is still unknown. During the progress of this thesis, we have observed that in response to ER stress stimuli, one of the first events that take place is the decline of both FLIP isoforms, FLIPL and FLIPS, at protein levels. We also demonstrate that downregulation of FLIP protein levels upon ER stress is a consequence of UPR-mediated protein synthesis inhibition and the subsequent proteasomal degradation of FLIP proteins. Furthermore, prior modulation of FLIPL levels controls caspase-8 activation and subsequent cell death in response to ER stress, whereas the modulation of FLIPS levels has a less obvious role. Most likely, the decline in FLIPL levels in response to ER stress in colon cancer cells undergoing ER stress favors the formation and processing of caspase-8 homodimers at the intracellular DISC, initiating the apoptotic process. In this regard, the ectopic expression of both isoforms, but mainly the FLIPL isoform, hinders this process, causing resistance to ER stress-induced apoptosis. Although many of the initial experiments in this thesis have been carried out in twodimensional (2D) monolayer cultures of colorectal cancer cells, we have also addressed the study of the regulation of the ER stress response in three-dimensional (3D) cultures (also known as multicellular tumor spheroids [MCTSs]), the latter of which reproduce, in vitro, certain features exhibited by solid tumors in vivo. In 3D cultures, a layer of proliferative cells surrounds other layers of quiescent cells and a necrotic nucleus in the deepest region of the spheroid. These metabolic differences are a consequence of the increasing nutrient and oxygen shortage in the deeper cellular layers. When facing ER stress, MCTSs, similar to 2D cultures, trigger the PERK-ATF4-CHOP-TRAILR2/DR5 proapoptotic pathway. However, unlike 2D cultures, FLIPL protein levels remain unchanged during ER stress treatment, which makes these cell models significantly more resistant to ER stress-induced apoptosis. These results reinforce FLIPL as a potential target in the treatment of colorectal cancer, in which its levels are frequently elevated. So as to increase knowledge of mechanisms regulating tumor cell response to ER stress, one of the overarching objectives of this thesis, we have also studied the role of the REDD1 protein, which is induced by different types of stresses, including ER stress. The role of REDD1 has been widely discussed and both pro- and anti-tumor functions have been associated with this protein. In 2D cultures of the HCT116 model, ER stress-inducing treatments lead to up-regulation of REDD1 levels, as a consequence of the PERK pathway, specifically through the transcription factor ATF4. Silencing of REDD1 expression by RNA interference prior to treatment with ER stress inducers significantly sensitizes HCT116 cells to ER stress-induced apoptosis, indicating its involvement in the adaptive response to prevent apoptosis. Although the function of REDD1 has generally been related to the indirect inhibition of the mTORC1 complex, master regulator of cellular metabolism, our results suggest that REDD1 adaptive role is mTOR-independent in colon cancer cells undergoing ER stress. These results were further confirmed in cells lacking REDD1, generated by CRISPR/Cas9 technology. In addition, we demonstrate that the greater sensitivity to ER stress of REDD1 deficient cells is associated with a further increase in both mRNA and protein levels of TRAILR2/DR5, as well as a greater activation of caspase- 8, all of which engage the extrinsic pathway of apoptosis. However, neither FLIP protein levels nor the PERK-ATF4-CHOP pathway were affected. Finally, taking into account these data and the fact that spheroids survive ER stress treatment, we determined the sensitivity to ER stress in spheroids generated from REDD1 deficient HCT116 cells. Our results clearly show that spheroids of REDD1 lacking cells are significantly more susceptible to ER stress-induced apoptosis than those generated from the parental HCT116 cell line. Collectively, these results point to an adaptive role of REDD1 that, together with the maintenance of FLIPL levels in tumor spheroids, may act to prevent the execution of the extrinsic pathway of apoptosis in response to ER stress in colon cancer cells, thus facilitating tumor progression.

Durante la progresión tumoral, las células tumorales se enfrentan a diferentes tipos de estreses como consecuencia de su crecimiento descontrolado y de la acción del microambiente tumoral. La escasez de nutrientes, tales como glutamina o glucosa, o la hipoxia aparecen y se acentúan con el crecimiento del tumor, ya que el intercambio de nutrientes y oxígeno, así como la eliminación de los residuos celulares en zonas más profundas del tumor, se ven comprometidos. Esto ocurre como resultado de una vascularización ausente o desorganizada e insuficiente para cumplir con los requisitos metabólicos, incrementados, de las células transformadas. Tanto la menor disponibilidad de glucosa y glutamina como de oxígeno dificultan el correcto plegamiento de proteínas en el retículo endoplasmático (RE), por el mal funcionamiento de la maquinaria enzimática implicada en dicho proceso o por la falta de modificaciones post-traduccionales en las proteínas recién sintetizadas. Además, la mayor tasa de proliferación de las células tumorales conlleva una mayor demanda de síntesis de proteínas por parte del RE. Todas estas alteraciones en las células tumorales favorecen el aumento de proteínas mal plegadas, dando lugar a una situación conocida como estrés en el RE. Generalmente, como respuesta al estrés en el RE, tanto células normales como transformadas ponen en marcha un conjunto de vías de señalización conocidas por el nombre de respuestas a proteínas mal plegadas (UPR, del inglés unfolded protein response), que agrupa a las rutas que parten (del inglés inositolrequiring protein 1), PERK (del inglés, protein kinase RNA-like ER kinase) y ATF6 (del inglés activating transcription factor 6), con el objetivo de restaurar la proteostasis en el RE y mantener la viabilidad y funcionalidad celular. En la fase adaptativa de la UPR, la síntesis general de proteínas disminuye aunque se favorece la síntesis de ciertas proteínas, tales como enzimas relacionadas con el plegamiento (por ejemplo foldasas o chaperonas) o proteínas relacionadas con la autofagia, así como componentes de la vía de degradación de proteínas asociada al RE (ERAD, del inglés endoplasmic reticulum associated degradation pathway), entre otras proteínas. Todo ello para intentar aliviar la carga de proteínas en el retículo. Sin embargo, si el estrés se prolonga o resulta excesivo, la UPR pone en marcha mecanismos que llevan a la muerte celular apoptótica (fase terminal de la UPR), que puede involucrar a la ruta intrínseca, la extrínseca o ambas de acuerdo al tipo celular. En concreto, en la línea celular de carcinoma colorrectal HCT116, principal modelo celular en esta tesis, la inducción del programa apoptótico como consecuencia de un estrés en el RE intenso y prolongado ocurre a través de la ruta PERK-ATF4-CHOP. Esta ruta finalmente conduce a un aumento de los niveles del receptor de TRAIL TRAILR2/DR5, específicamente en el compartimento intermedio RE-Golgi (ERGIC, del inglés endoplasmic reticulum [ER]-Golgi intermediate compartment). El agrupamiento de los receptores TRAILR2/DR5 tiene lugar en dicho compartimento así como el ensamblaje del complejo inductor de muerte (DISC, del inglés death inducing signaling complex), lo que lleva al procesamiento y consecuente activación de la caspasa-8 iniciadora del proceso de apoptosis. Una vez activa, la caspasa-8, a su vez, activa proteolíticamente a las caspasas efectoras 3 y 7 y pone en marcha a la ruta intrínseca de la apoptosis a través del procesamiento de la proteína BH3-only BID, amplificando la activación de las caspasas efectoras, últimas responsables del desmantelamiento de la célula. Curiosamente, el agrupamiento de TRAILR2/DR5 y posterior ensamblaje del DISC ocurre independientemente de su ligando canónico TRAIL, actuando como tal las mismas proteínas desplegadas o mal plegadas a través de determinadas regiones hidrofóbicas expuestas en estas proteínas. A pesar de la relación entre la ruta extrínseca y el estrés en el RE, la función de las proteínas FLIPL/S, claves en el control de la activación de la caspasa-8 en el DISC ensamblado en respuesta a TRAIL, no se había explorado. Durante el desarrollo de esta tesis, hemos determinado que en respuesta a diversos estímulos de estrés en el RE, uno de los primeros eventos que tienen lugar es la caída a nivel de proteína de ambas isoformas de FLIP, FLIPL y FLIPS, y que dicha disminución ocurre como consecuencia de la inhibición de la síntesis de proteínas desencadenada por la UPR y la posterior degradación proteosomal de ambas. La previa modulación de los niveles de FLIPL controla la activación de la caspasa-8 y la posterior muerte celular en respuesta al estrés en el RE, teniendo unos efectos menos evidentes la modulación de los niveles de FLIPS. Probablemente, los menores niveles FLIPL en respuesta al estrés en el RE favorecen la formación y procesamiento de homodímeros de caspasa-8 en el DISC intracelular. Sin embargo, la expresión ectópica de ambas isoformas, pero principalmente FLIPL, dificulta dicho proceso provocando resistencia a la apoptosis inducida por estrés en el RE. Aunque muchos de estos experimentos se han llevado a cabo en cultivos en monocapa o bidimensionales (2D), también hemos abordado la respuesta a estrés en el RE en cultivos tridimensionales (3D) de esferoides (también denominados MCTSs, del inglés multicellular tumor spheroids), los cuales reproducen in vitro algunas de las características observadas en tumores sólidos in vivo. En cultivos 3D encontramos una población celular heterogénea, en la que una capa de células proliferativas envuelve otra capa de células quiescentes y un núcleo necrótico en la zona más profunda del esferoide. Estas diferencias metabólicas ocurren como consecuencia de la mayor escasez de nutrientes y oxígeno en las capas celulares más profundas. En respuesta al estrés en el RE, los esferoides ponen en marcha, al igual que en los cultivos 2D, la ruta pro-apoptótica PERK-ATF4-CHOP-TRAILR2/DR5 aunque, a diferencia de éstos, los niveles de proteína FLIPL se mantienen inalterados en los esferoides durante el tratamiento de estrés, lo que significativamente hace a este modelo celular más resistente a la apoptosis inducida por estrés en el RE. Estos resultados refuerzan a FLIPL como una diana en el tratamiento del cáncer colorrectal, donde sus niveles están frecuentemente aumentados. Teniendo como objetivo global el conocimiento de los mecanismos que regulan la respuesta de células tumorales al estrés en el RE, en esta tesis hemos analizado también el papel de la proteína REDD1, inducible por distintos tipos de estreses, entre los que se encuentra el estrés en el RE. El papel de REDD1 ha sido ampliamente discutido y tanto funciones pro- como anti-tumorales se han asociado a esta proteína. En cultivos 2D del modelo HCT116, los tratamientos inductores de estrés en el RE llevan a un aumento en los niveles de REDD1, como consecuencia de la ruta de PERK, específicamente a través del factor de transcripción ATF4. El silenciamiento de la expresión de REDD1 con oligonucleótidos de interferencia previo al tratamiento con inductores de estrés en el RE significativamente sensibiliza a las células al mismo, lo que indica su participación en la respuesta adaptativa de prevención de la apoptosis. A pesar de que la función de REDD1 se ha relacionado generalmente con la inhibición indirecta del complejo mTORC1, regulador fundamental del metabolismo celular, en relación al estrés en el RE nuestros resultados indican que REDD1 puede también desempeñar un papel adaptativo independiente de mTOR en estas células tumorales. Estos resultados fueron confirmados en células carentes de REDD1, generadas mediante la tecnología CRISPR/Cas9. Además, la mayor sensibilización al estrés en el RE en estas células ocurre como consecuencia de un mayor aumento tanto a nivel de ARNm como de proteína de TRAILR2/DR5, así como de una incrementada activación de la caspasa-8, todo ello comprometiendo la ruta extrínseca de la apoptosis sin afectar a los niveles de FLIP ni a la vía PERK-ATF4-CHOP. Finalmente, teniendo en cuenta estos datos y que los esferoides sobreviven al tratamiento de estrés en el RE, se generaron esferoides a partir de células HCT116 carentes de REDD1, los cuales demostramos que son significativamente más susceptibles al estrés en el RE que aquellos generados a partir de la línea parental. En conjunto, todos estos resultados señalan un papel adaptativo de REDD1 que, conjuntamente con el mantenimiento de los niveles de FLIPL, actuaría limitando la ejecución de la ruta extrínseca de la apoptosis en respuesta al estrés en el RE en células de cáncer de colon, facilitando de esta forma la progresión tumoral.