Mejora del cóctel enzimático de hidrólisis de biomasa vegetal mediante modificación genética de Myceliophthora Thermophila.

Abstract

El aumento del precio de los combustibles fósiles y su demanda junto con el daño que causan las emisiones de efecto invernadero derivadas de su uso han incrementado el interés mundial por las fuentes de energía alternativas, especialmente las renovables. Los biocombustibles se han posicionado como una alternativa potencial a los combustibles de transporte derivados de petróleo, en concreto, el que más atención ha recibido es el bioetanol de segunda generación que se obtiene a partir de biomasa lignocelulósica procedente de residuos agrícolas y forestales sin valor alimenticio. Sin embargo, su coste de producción todavía no llega a ser competitivo debido al alto coste de la tecnología de conversión. La biomasa lignocelulósica que consiste principalmente en celulosa, hemicelulosa y lignina es la fuente renovable más abundante para la producción de biocombustibles. El uso industrial de la biomasa vegetal implica cuatro etapas principales: pretratamiento, hidrólisis enzimática, fermentación y purificación. La etapa de hidrólisis enzimática y el coste de producción de enzimas sigue representando el mayor cuello de botella, principalmente porque algunas de las enzimas producidas tienen baja actividad catalítica en condiciones industriales y los cócteles enzimáticos no están optimizados para dichas condiciones específicas. Por tanto una de las claves es mejorar la calidad de las enzimas individuales así como la composición del cóctel para sustratos y condiciones específicas. En este contexto se encuadra el trabajo de esta Tesis Doctoral en la que se aborda la mejora del cóctel enzimático de hidrólisis de biomasa vegetal mediante la modificación genética del hongo productor Myceliophthora thermophila. En un primer bloque se afrontó la eliminación de aquellas enzimas presentes en el cóctel enzimático que no contribuyen a la eficiencia de hidrólisis con el fin de favorecer la producción de aquellas que sí lo son y aumentar el rendimiento de producción de glucosa. Las candidatas fueron dos enzimas con significativa representación en el cóctel enzimático producido por M. thermophila pero inactivas o ineficientes en las condiciones de proceso industrial. Concretamente una enzima no celulolítica no activa en el cóctel, la quitinasa 2, y una enzima celulolítica con actividad redundante y poco eficiente, la endoglucanasa 6. En esta línea se eliminaron secuencialmente los genes que codifican para estas enzimas mediante la estrategia de casete de deleción. La eliminación de estas enzimas resultó en la producción de un cóctel más eficiente y en un aumento del rendimiento de liberación de glucosa durante el proceso de hidrólisis de rastrojo de maíz pretratado debido a la redistribución de la capacidad de producción del hongo. En un segundo bloque se abordó la mejora genética de una de las actividades celulolíticas principales. Se trata de la enzima β-glucosidasa de M. thermophila con elevada actividad transglicosilante, lo que supone una pérdida de rendimiento en la producción de glucosa. En esta línea se llevó a cabo la mejora de la enzima mediante evolución dirigida con la finalidad de disminuir su actividad transglicosilante y por consiguiente aumentar el rendimiento final de liberación de glucosa. Se encontró una variante de la enzima β-glucosidasa con capacidad de transglicosilación reducida para la hidrólisis del material celulósico mediante mutagénesis aleatoria y la posterior exploración de la propiedad deseada. Esta variante mostró además un incremento de su actividad de hidrólisis sin afectar a su termoestabilidad.