Síntesis de compuestos organoselénicos derivados del hidroxitirosol. Determinación de su actividad como antioxidantes

Abstract

1. Introducción Los polifenoles son una amplia familia de compuestos que se encuentran, entre otros alimentos, en la fruta, la verdura, el vino, el té, el cacao y el aceite de oliva virgen extra y que muestran una marcada actividad antioxidante, que se traduce en una contrastada actividad en la prevención de enfermedades cardiovasculares, cáncer, enfermedades neurodegenerativas, diabetes u osteoporosis . Uno de los polifenoles más efectivos como antioxidante y atrapador de radicales libres es el hidroxitirosol (HT), 1, 4-(2-hidroxietil)-1,2-bencenodiol, un fenol simple que predomina en el olivo (Olea europea). La industria del aceite de oliva genera grandes cantidades de residuos (alperujo) que contienen una variedad de polifenoles entre los que destaca el HT. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha desarrollado bajo patente un sistema para su purificación a escala semiindustrial, que permite obtenerlo con un alto grado de pureza (95%-99%) y a bajo coste. Un inconveniente importante es que el hidroxitirosol es químicamente inestable, a menos que se preserve seco en ausencia de aire y luz, por lo que la eficiencia de esta molécula añadida en su forma nativa a matrices biológicas no se puede garantizar; tampoco se puede añadir a preparados lipofílicos debido a su relativa polaridad. En base a estas consideraciones, sería útil producir derivados del hidroxitirosol más estables y que conservaran sus diversas propiedades biológicas, utilizando como materia prima el HT aislado del alperujo. Los compuestos que incluyen selenio en su estructura son objeto de controversia. Se ha demostrado el envenenamiento de animales por plantas acumuladoras de selenio en suelos seleníferos. Sin embargo, a mediados de los años 50 se consideró un nutriente esencial presente en algunas selenoproteínas como glutatión peroxidasa, implicada en un mecanismo de autodefensa contra el estrés oxidativo. Estudios epidemiológicos y clínicos en humanos, así como ensayos de laboratorio, apoyan el papel protector del selenio frente al desarrollo del cáncer. A lo largo del periodo de disfrute de la beca se ha desarrollado una amplia investigación que se puede englobar en los siguientes apartados: - Síntesis de dopamina a partir de hidorxitirosol. Síntesis de gluco y galactoderivados de dopamina. - Síntesis de selenoureas y selenuros de hidroxitirosol. - Síntesis de tioureas derivadas de hidroxitirosol y reacciones de oxidación de las mismas con dicloro-diciano-quinona (DDQ). - Reacciones de aldehídos catalizadas por el sistema CeCl3.7H2O-NaI-SiO2 - Evaluación de las propiedades biológicas in vitro y ex vivo de los compuestos sintetizados. 2. Resultados y discusión 2.1. Síntesis de dopamina y derivados glicosilados de dopamina 2.1.1. Síntesis de dopamina a partir de hidroxitirosol La síntesis de dopamina partiendo del hidroxitirosol (1) se ha abordado por dos vías diferentes: a) Por una parte, con objeto de evitar reacciones secundarias debida a las reactividad del fragmento de catecol, fácilmente oxidable, hemos llevado a cabo la protección de los hidroxilos aromáticos por reacción con ¿,¿-dicloro-o-xilileno para dar 2. Por tratamiento de 2 con tetrabromuro de carbono y trifenilfosfina se obtuvo el derivado bromado 3, que es fácilmente convertido en el azido derivado 4 por tratamiento con azida sódica en DMF. Por hidrogenación catalítica a temperatura ambiente, en presencia de ácido clorhídrico, se consigue la reducción del grupo azido y la eliminación simultanea del grupo protector (Esquema 1), obteniéndose así el hidrocloruro de dopamina (5), que se aísla por precipitación en etanol-éter. Esquema 1 b) Por otra parte, hemos obtenido el clorhidrato de la dopamina (5) en solo tres pasos y según se indica en el esquema 2, añadiendo al medio de reacción ascorbato sódico que evita la oxidación del fragmento de catecol. Los rendimientos obtenidos por ambos procedimientos son similares, aunque en este segundo procedimiento hay una etapa menos. Esquema 2 2.1.2. Síntesis de glicósidos de la dopamina

A partir del hidroxitirosol (1), por tratamiento con cloruro de tosilo en piridina se obtuvo el compuesto tri-O-tosilado 8. De los tres grupos tosiloxi, sólo el que está sobre la cadena lateral se desplaza por el grupo azido para dar 9. El tratamiento de 9 con potasa metanólica rindió una mezcla de los regioisómeros 10 y 11 al 50%, según se deduce de los espectros de RMN, no separables cromatográficamente. (Esquema 3) Esquema 3 La preparación de los glicosilderivados de 10 y 11 se realizó por tratamiento de la mezcla de 10 y 11 con el bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-¿-D-glucopiranosilo, que rindió los ¿-D-glucopiranosil derivados 12 y 13, y el bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-¿-D-galactopiranosilo, que rindió los derivados 14 y 15. La des-O-acetilación y des-O-tosilación de estos compuestos se produce simultáneamente por tratamiento con potasa metanólica. La reducción catalítica en medio ácido de los glicosil derivados desprotegidos conduce a la formación de los glicosil derivados de dopamina 20-23, donde la presencia del azúcar pudiera ejercer una acción moduladora de la actividad biológica de la dopamina (Esquema 4). Esquema 4 2.2. Selenoderivados de hidroxitirosol 2.2.1. Selenoureas derivadas de hidroxitirosol Con objeto de combinar las propiedades antioxidantes del fragmento de catecol del hidroxitirosol con las que presentan los compuestos organoselénicos, hemos preparado selenoureas O-protegidas y no protegidas derivadas de la dopamina. Para las protegidas se partió de un derivado comercial del hidroxitirosol, el bromuro de 2-(3,4-dimetoxifenil)etilo 24, que fue convertido en el correspondiente azido derivado 25. La hidrogenación catalítica de 25 condujo a la formación de la dopamina di-O-metilada 26, y de un producto secundario con la estructura dimérica 27. (Esquema 5) Esquema 5 La amina protegida 26 o la dopamina 5 reaccionaron con los isoselenocianatos 28, 29 y 30, sintetizados previamente a partir de sus correspondientes arilaminas según un procedimiento desarrollado previamente por nuestro grupo de investigación. De esta manera hemos preparado las selenoureas 31-36, con rendimientos casi cuantitativos (Esquema 6) Esquema 6 La misma reación, llevada a cabo con el diisoselenocianato 37 condujo a la obtención las diselenoureas 38 y 39 (Esquema 7). Esquema 7 2.2.2. Síntesis de selenuros y diselenuros del hidoxitirosol. También hemos sintetizado selenuros y diselenuros derivados del hidroxitirosol. Para ello, hemos preparado previamente selenuro sódico (Na2Se) y diselenuro sódico (Na2Se2) a partir del selenio elemental según el método descrito por Milton y col. Por reacción del bromuro de 3,4-dihidroxifeniletilo 24 con selenuro sódico y diselenuro sódico se obtuvieron respectivamente el selenuro 40 y el diselenuro 41. La desprotección con tribromuro de boro según el tratamiento descrito por Thahanovsky y col. de 41 rindió el selenuro 43, pero en el caso del monoselenuro 40 en lugar del monoselenuro correspondiente, se obtuvo un compuesto inesperado, al que en base a datos espectroscópicos se ha asignado la estructura del selenonio 42. (Esquema 8) Esquema 8 Una ruta alternativa para la obtención del diselenuro 43 consiste en la acetilación de los grupos hidroxilo de catecol en el bromoderivado 6, seguida de tratamiento con la sal de selenio y posterior desacetilación mediante catálisis básica con carbonato potásico. (Esquema 9) Esquema 9 Reacciones análogas se llevaron a cabo utilizando como grupo protector de los hidroxilos aromáticos el xilileno. Así, la reacción del compuesto 3 con selenuro y diselenuro sódico condujo a la formación de los selenuro y diselenuro O-protegidos 46 y 47 respectivamente. Todos los intentos de eliminación del grupo protector en 46 y 47 han sido hasta el momento infructuosos. (Esquema 10) Esquema 10 2.3. Síntesis de tioureas derivadas de la dopamina De forma análoga a la descrita en el apartado 2.2.1., hemos llevado a cabo la preparación de las tioureas 53-57, que portan el fragmento de catecol, por reacción del hidrocloruro de dopamina con los isotiocianatos 48-52. (Esquema 11) Esquema 11 El tratamiento de las tioureas 53-57 con DDQ (58), según el método propuesto por Land condujo a la formación de los derivados de 8,9-dihidro-5-tia-7-azo-benzocicloheptano 59-63, según se indica en el Esquema 12: Esquema 12 La oxidación de las tioureas 53-57 con DDQ dio como subproducto el difenol 61, que mostró la misma movilidad cromatográfica que las tiacepinas 59-63, por lo que su separación y purificación no fue factible. Para solventar ese problema, la mezcla de reacción se acetiló con anhídrido acético y piridina, obteniéndose los compuestos 65-69 y el diacetil-dicloro-difenil benceno 70. Los acetil derivados 65-69 pudieron ser así separados cromatográficamente del subproducto 70. La desacetilación con carbonato potásico de 65-69 produjo la eliminación selectiva de los acetatos unidos a los oxígenos aromáticos, pero no la del grupo acetilo unido al nitrógeno ureídico, obteniéndose así los derivados 71-75. (Esquema 13) Esquema 13 2.4. Reacciones de aldehídos catalizadas por el sistema CeCl3.7H2O-NaI-SiO2 Con objeto de aplicar como reactivo la combinación de CeCl3-NaI-SiO2, desarollado por Marcantoni y col., en la preparación de derivados del hidroxitirosol en ausencia de disolvente (Química verde), se ha llevado a cabo en colaboración con dicho profesor, un estudio del empleo de este catalizado en diferentes reacciones. Concretamente, a partir de derivados del benzaldehído y de nitroacetato de etilo se ha podido llegar en un solo paso y en ausencia de disolvente a los isoxazoles 74 y 75. (Esquema 14) Esquema 14 2.5. Ensayos de capacidad antioxidante El objetivo principal de los ensayos de antioxidación es estudiar la actividad antioxidante de las estructuras derivadas del hidroxitirosol anteriormente descritas, obtenidas vía sintética. También se estudió por primera vez el efecto del hidroxitirosol sobre la enzima tirosinasa y su comparación con los derivados de hidroxitirosol que incluyen selenio en su molécula. La actividad inhibidora de otros derivados con selenio (carbohidratos conteniendo selenio, derivados de selenoureas,¿) había sido ya demostrada por otros autores. Para investigar la actividad antioxidante de los compuestos se han seguido las recomendaciones que existen hoy en día de utilizar al menos dos diferentes tipos de ensayos y también de combinar ensayos como el poder reductor o el de secuestro de radicales libres, tales como DPPH y ABTS, y ensayos que están asociados a la peroxidación de lípidos. En relación a estos últimos se han seguido los primeros estadíos de la peroxidación de lípidos mediante el método del tiocianato férrico y el estado final de la peroxidación mediante el método del ácido tiobarbitúrico (TBA). Se realizaron también ensayos ex vivo midiendo la capacidad de los nuevos productos sintéticos para inhibir la peroxidación lipídica en microsomas de hígados de ratas alimentadas con una dieta deficiente en vitamina E. 2.5.1. Ensayos in vitro Se evaluaron las actividades antioxidantes de los compuestos obtenidos por síntesis orgánica a partir del hidroxitirosol (1). Dentro de los selenoderivados se estudiaron tres derivados selenoureídos 34, 35 y 36, el diselenuro 43 y el selenonio 42 En los análisis llevados estos compuestos se comparan con las vitamina E (81) y vitamina C (82), ampliamente usadas por sus características antioxidantes y de origen natural. También con el hidroxitirosol (1) y 3,4-dihidroxifenil glicol (83), recuperados de los alperujos y con una importante actividad antioxidante; con el trolox (84), análogo a la vitamina E soluble en agua, que se utiliza como estándar, que se utiliza en muchos de los ensayos como referencia a la hora de expresar los resultado en términos de ¿Capacidad Antioxidante Equivalente al Trolox¿ (CAET). Y con la dopamina (5), compuesto de estructura similar al hidroxitirosol en el que el grupo hidroxilo se ha sustituido por un grupo amino, que posee una marcada importancia biológica como neurotransmisor (Esquema 15). Esquema 1 Además se probaron también las tioureas no comerciales 53-57. Se prepararon disoluciones madre de los compuestos a ensayar y a partir de ellas los distintos patrones de ensayo, cuyas concentraciones varían en función del experimento, si bien el hidroxitirosol, el 3,4-dihidroxifenilglicol y la dopamina se disolvieron en agua, la vitamina C, la vitamina E, las selenoureas 34, 35 y 36 y el selenonio 42, en metanol, y el resto en agua-metanol en proporción 1:1. Para investigar la actividad antioxidante de los compuestos se han seguido las recomendaciones que existen hoy en día de utilizar al menos dos diferentes tipos de ensayos y también de combinar ensayos como el poder reductor o el de secuestro de radicales libres, tales como DPPH y ABTS, y ensayos que están asociados a la peroxidación de lípidos. En relación a estos últimos se han seguido los primeros estadíos de la peroxidación de lípidos mediante el método del tiocianato férrico y el estado final de la peroxidación mediante el método del ácido tiobarbitúrico (TBA). Poder reductor La capacidad reductora de un compuesto puede ser un buen indicador de su potencial antioxidante. Con este ensayo se muestra la capacidad de donar hidrógeno o electrones de cada uno de los compuestos anteriores. El fundamento de este método es la reacción redox mediante la cual el Fe (III) se reduce a Fe (II) a expensas de un reductor, y el estudio colorimétrico del complejo formado por el Fe (II) con bipiridilo que absorbe a 490 nm. Para expresar los resultados se establece una curva de calibración con cantidades conocidas de trolox y el poder reductor de los compuestos se expresa en equivalentes Trolox (mM). Las líneas dosis-respuesta de todos los compuestos se ajustan a un modelo lineal con un r ¿ 0.90, siendo calculado el poder reductor por su ecuación de regresión individual. En Figura 1 se comparan los valores absolutos de poder reductor que se obtuvieron en los ensayos. El hidroxitirosol (1) mostró un poder reductor de 1.11 mM trolox, similar al glicol (1.18 mM trolox), y a la vitamina C (1.01 mM trolox). Los valores que presentaron las selenoureas 34, 35 y 36 fueron 2.5, 1.8 y 2.1 veces superiores al hidroxitirosol respectivamente, aunque en este sentido más interesantes fueron los selenoderivados 43 (5.0) y 42 (3.7). (Tabla 1) Actividad antirradical, captación de radicales DPPH y ABTS La capacidad de secuestro de radicales libres, los cuales inician o propagan la peroxidación de lípidos, también es un importante mecanismo antioxidante. El método del DPPH (1,1-difenil-2-pricrilhidrazil) es un método simple y altamente sensible que está basado en que el DPPH*, radical estable en disolución, acepta átomos de hidrógeno procedente de los antioxidantes neutralizando su carácter de radical libre. El efecto antioxidante es proporcional a la desaparición del DPPH* en los compuestos ensayados. La correlación entre concentración de antioxidante y descenso en DPPH* fue alta en todos los casos r ¿ 0.90. Los resultados se pueden expresar en comparando las pendientes de las rectas obtenidas con la correspondiente al Trolox (TEAC). Los mayores valores se obtuvieron para el diselenuro 43, el selenonio 12 y la selenourea 35. También puede representarse la EC50, la concentración efectiva (mM) de los compuestos ensayados necesaria para disminuir en un 50% la concentración inicial del radical DPPH* (Figura 2). En todos los casos la actividad antiradical de los derivados (valores de EC50 más bajo indican mayor actividad antioxidante) superan ampliamente a la de la vitamina E (81), son del orden del hidroxitirosol (1), siendo la actividad más importante la de la dopamina (5). (Tabla 2). Más notable es la diferencia de actividad antirradical en el caso del radical catión estable ABTS*+ que se obtiene por reacción del 2,2'-azinobis-(ácido 3-etilbenzotiazolin 6- sulfónico) con K2S2O8. En este caso la actividad antioxidante de los productos se determina por la decoloración del ABTS*+ que producen. Los resultados se pueden expresar igual en equivalentes Trolox (TEAC) o en EC50. Ambos ensayos de captación de radicales libres DPPH y ABTS se evalúan frente a soluciones estándar de trolox 30¿250 µM. El procedimiento en el caso del ABTS consistió en crear primero tres rectas patrón para el trolox (84) a tres longitudes de onda diferentes, 415 nm, 655 nm y 750 nm. Las pendientes de las rectas obtenidas se utilizaron para calcular los equivalente de trolox (TEAC) (Pendiente antioxidante/Pendiente trolox), y expresando el resultado como una media del valor a esas tres longitudes de onda. La capacidad antioxidante total del compuesto que está bajo estudio es expresada en equivalentes trolox (TEAC), que es definido como la concentración de un antioxidante que da el mismo porcentaje de cambio de absorbancia para DPPH o ABTS que 1 mM de trolox. La capacidad de captación de estos radicales por parte de los antioxidantes obtenidos por vía sintética es mayor que en el caso de vitamina E (81) e hidroxitirosol (1). Además de 42 y 43, también la selenourea 36 y la tiourea 56 superan en 5 veces la capacidad de captación de radicales ABTS del trolox (84). El resto de derivados sintéticos del hidroxitirosol muestran un TEAC entre 2 y 3.5 veces superior a 84, lo que pone de manifiesto el elevado poder antirradical de estas moléculas. Los valores más bajos obtenidos por los compuestos en los ensayos DPPH frente al método ABTS refleja la baja fuerza oxidante del radical DPPH. El radical ABTS parece más reactivo que el radical DPPH* y mientras que la reacción con DPPH* incluye una transferencia de átomos de hidrógeno, en el caso de la reacción con ABTS esta incluye un proceso de transferencia de electrones. Peroxidación de lípidos y productos de oxidación secundarios en los ensayos de actividad antioxidantes Ensayo del tiocianato férrico (TCF) En este ensayo se inicia la reacción de oxidación de un ácido graso insaturado como es el ácido linoléico en emulsión mediante la adición de 2,2'-azo-bis(2-amidinopropano) (ABAP), que produce radicales libres del tipo peroxilos de forma constante hasta formar hidroxiperóxidos durante el estado inicial de oxidación. Al añadir antioxidantes al medio, éstos competirán por los radicales, protegiendo al linoleico. La reacción determina los niveles de hidroxiperóxido lipídico de forma indirecta mediante un método colorimétrico. Al añadir tiocianato amónico y cloruro ferroso, el Fe(II) reacciona con los hidroperóxidos que se forman en la oxidación del ácido linoléico, pasando a Fe(III), que forma un complejo coloreado con los iones tiocianato. A menor formación de hidroperóxidos menos color, y por tanto menor absorbancia, siguiendo una curva del tipo y = a + b¿x para todos los compuestos ensayados con un r ¿ 0.90. De la ecuación de esa curva puede extraerse el EC50, es decir, la concentración mM de antioxidante que habría que añadir para inhibir la oxidación de linoleico un 50%. Valores bajos del EC50 indican una elevada capacidad para disminuir la oxidación del ácido linoleico. Los selenoderivados 42 y 43 vuelven a ser los más significativos, pues inhiben esta reacción con una concentración hasta diez veces menor que el hidroxitirosol. No obstante, los estándares vitamina E (81) y trolox (84) testados aportaron importantes valores en este ensayo. El diselenuro 43 inhibe la oxidación primaria hasta en un 80%, situándose las selenoureas 34-36, y las tioureas 53-57 entre el 30 y 50%, superando el 20% que inhibe el hidroxitirosol. (Tabla 4) Inhibición de la oxidación secundaria por el método del linoleico/TBA Al igual que en el caso anterior, las propiedades antioxidantes de los compuestos son probados en presencia de un inductor de la peroxidación. El ácido linoleico es oxidado con ABAP en un calentamiento prolongado a 50 ºC durante 24 horas y los productos finales o secundarios de esta reacción, como el malonaldehído, se hacen reaccionar con ácido tiobarbitúrico formando un compuesto coloreado, que puede ser detectado espectrofotométricamente. El grado de coloración indica la actividad del antioxidante que se mide por el descenso de absorción a 540 nm. El análisis de regresión de las curvas dosis-respuesta para los compuestos ensayados confirma que no es un modelo lineal sino que se ajusta a y = a + b¿x, con un r ¿ 0.90, de la que se extraen, igual que anteriormente, los valores de EC50. En este caso se necesitan concentraciones menores para evitar las reacciones de oxidación secundaria. En este menor rango de concentraciones el comportamiento de los antioxidantes es análogo a la inhibición de la oxidación primaria, siendo la concentración necesaria en torno a cuatro veces menor que la del hidroxitirosol. 2.5.2. Efecto sobre la actividad de la tirosinasa de hongos in vitro Se estudiaron las características inhibidoras sobre la tirosinasa de hongo de los compuestos sintetizados, conteniendo átomos de selenio en su molécula (42 y 43) y se compararon con las del hidroxitirosol natural de donde proceden. Este enzima cataliza las primeras dos reacciones de la síntesis de la melanina, la hidroxilación de la L-tirosina para dar 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y la oxidación de la L-DOPA a dopaquinona. Esta quinona es altamente reactiva y puede polimerizar espontáneamente a melanina. Los efectos de los compuestos 42 y 43, sobre las actividades de monofenolasa, utilizando L-tirosina como sustrato y de difenolasa sobre L-DOPA, se siguieron mediante la inhibición de la formación del dopacromo mediante medidas espectrofotométricas. Cuando la reacción enzimática se lleva a cabo con L-tirosina como sustrato se observa un marcado tiempo ¿lag¿ o de retraso, característico de actividad monofenolasa, tiempo necesario para alcanzar una concentración determinada de o-difenol. Este periodo se acorta o se elimina en presencia de los compuestos ensayados con o-difenoles en sus estructuras También se comprueba que los compuestos ensayados incluido el hidroxitirosol ralentiza la formación de dopacromo cuando L-tirosina se utiliza como sustrato, comportándose por tanto como inhibidor de la actividad monofenolasa de la tirosinasa del hongo. Gráfica 1. Inhibición de la actividad monofenolasa de la tirosinasa por el hidroxitirosol Cuando se estudia la actividad difenolasa, usando L-DOPA como sustrato en presencia de los compuestos también se confirma que todos producen una reducción de actividad difenolasa, siendo quizás el efecto sobre la actividad monofenolasa más importante que sobre la difenolasa. De todos los compuestos analizados el que presenta un efecto inhibidor más importante es el selenonio (42) el diselenuro (43) e hidroxitirosol (1). Concentraciones de los derivados de selenio entre 0.05-0.65 ¿M producen una importante inhibición de la monofenolasa. En el caso del hidroxitirosol se ha comprobado que se comporta de dos formas muy diferentes si se utilizan a una baja o media concentración (5-80 ¿M) o muy alta (1500-2000 ¿M), produciéndose en este caso una inhibición muy rápida e importante de la producción de dopacromo, en el caso de la monofenolasa. 2.5.2. Ensayos ex vivo. Inhibición de peroxidación microsomal. Los productos a ensayar se incubaron, siguiendo el protocolo de Mitchell y col. , con microsomas hepáticos (vesículas que resultan de la fragmentación del retículo endoplasmático de las células del hígado de ratas), tras 20 minutos de estrés oxidativo inducido por el quelato de Fe(II)-ADP y ascorbato. El daño oxidativo se midió entonces por la formación de TBARS (productos de la degradación oxidativa incluido el malonaldehído procedente de la peroxidación mediada por radicales libres de los ácidos grasos insaturados de la membrana lipídica): cuanto menor sea la cantidad de TBARS formado, mayor efecto protector en la membrana. Los microsomas obtenidos de ratas deficientes en vitamina E (¿VE) se emplearon para determinar el diferente efecto protector de los compuestos a testar, comparándolos con microsomas obtenidos de ratas sometidas a una adecuada dieta en VE (+VE), y con la vitamina E, que es el principal antioxidante lipídico soluble en membranas biológicas , y finalmente microsomas ¿VE a los que se adicionó tocoferol en las mismas concentraciones que los compuestos a ensayar. Los resultados obtenidos para el diselenuro 43 en concentraciones 0.250 mM, 0.100 mM y 0.050 mM, y el selenonio 42 en concentraciones finales de 0.266 mM, 0.106 mM y 0.053 mM se muestran en las Tabla 6. El selenonio 42 presenta una inhibición significativa a concentración 0,266 mM, y cuando es menor se convierte en prooxidante, es decir, favorece la oxidación en lugar de inhibirla. Sin embargo, el diselenuro 43 es un potentísimo inhibidor de la oxidación en microsomas a cualquiera de las concentraciones de ensayo, presentando valores análogos a los que proporcionan el ¿-tocoferol o los microsomas +VE, provenientes de ratas que no han sido sometidas a estrés oxidativo debido a una deficiencia de vitamina E. Los valores obtenidos para las selenoureas 34-36 aparecen representados en la Tabla 7. Todas las selenoureas muestran una inhibición prácticamente total a una concentración 0.250 mM, casi idéntica a la que proporciona el tocoferol. A concentración 0.100 mM el efecto inhibidor, aunque menor, continúa siendo alto para las selenoureas 34 y 36, y total para 35. Para disoluciones de selenoureas 0.050 mM en microsomas, se sigue observando una importante inhibición, algo mayor nuevamente para el selenoderivado 35. En las pruebas realizadas con los microsomas hepáticos tratados con las tioureas 54-57, se utilizaron concentraciones finales de los mismos de 0.250, 0.100 y 0.050 mM. También se emplearon los controles con +VE, y ¿-tocoferol. Los resultados obtenidos se expresan en la Tabla 9. Las cuatro tioureas ensayadas se comportan como buenos inhibidores de la oxidación microsomal a las concentraciones ensayadas, siendo el potencial inhibidor 56>54>57>55, es decir, mayor con las tioureas preparadas a partir de aminas alifáticas que a partir de aminas aromáticas. Actualmente la tesis se encuentra en fase de redacción. El procedimiento de síntesis y propiedades de la mayor parte de los compuestos de esta tesis ha sido incluido en una patente que ha sido presentada en la Oficina de Patentes y Marcas. Antioxidantes en los alimentos Aceites y grasas vegetales

Los carbohidratos juegan un papel fundamental en importantes eventos biológicos como la infección, inflamación, señalización celular, metástasis tumoral, etc. En estos procesos tiene lugar la interacción proteina-carbohidrato. Esta interacción se caracteriza por una baja afinidad que es compensada en la naturaleza por la presentación de numerosas copias tanto de los carbohidratos como de los correspondientes receptores, para dar lugar a interacciones multivalentes que aumentan la afinidad y la selectividad de estos procesos de reconocimiento. Una familia importante de receptores son los PRRs (receptores de reconocimiento de patrones moleculares) que interaccionan con estructuras conservadas y necesarias para la supervivencia de microorganismos, participando de forma activa en la generación de la respuesta inmunitaria inicial. Uno de estos PRRs, DC-SIGN (dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin), juega un papel fundamental en los procesos infecciosos de muchos patógenos, como M. tuberculosis, Schistosoma mansoni, el virus de la hepatitis C, el citomegalovirus, el virus del Dengue, el VIH y el virus del ébola. Esta lectina, presente en la membrana celular de células dendríticas, es capaz de reconocer proteínas altamente glicosiladas, generalmente conteniendo estructuras de oligosacáridos manosiladas y fucosiladas. Basado en estos datos y en la experiencia previa de nuestro grupo de investigación en la preparación de sistemas multivalentes de carbohidratos, se han preparado en esta tesis doctoral estructuras glicodendríticas para la interacción con la lectina DC-SIGN y la evaluación de sus actividades biológicas. Usando una estrategia sintética convergente y la reacción de cicloadición entre azidas y alquinos catalizada por Cu(I) (CuAAC), se han podido sintetizar diferentes estructuras dendriméricas que se han funcionalizado con distintos carbohidratos. Esta aproximación ha permitido la formación de una pequeña biblioteca de glicodendrímeros derivados de manosa, fucosa y de un mimético del disacárido natural (man-¿-1,2-man) con buenos rendimientos, de forma eficiente. Algunos de estos compuestos han mostrado buenas actividades en ensayos de competición con la lectina DC-SIGN, utilizando para ello un biosensor con detección por SPR (IC50 ~ 1 ¿M) y un ensayo de inhibición de infección utilizando un modelo del virus del ébola (IC50 ~ 1 ¿M). Además, se ha seleccionado otro tipo de soporte multivalente para una presentación masiva de carbohidratos en su superficie. Este soporte está basado en una partícula viral no natural que se ha funcionalizado con glicodendrones de primera y segunda generación. Usando la reacción CuAAC, se han preparado dos partículas virales altamente monodispersas, con valencia de hasta 1620 copias de manosas, dando lugar a los sistemas multivalentes de carbohidratos con mayor valencia (de forma monodispersa) descritos hasta la fecha. Estos sistemas multivalentes de manosa han dado valores de inhibición en un ensayo de infección dependiente de DC-SIGN muy importantes, del orden del nM¿pM. Por último, en esta tesis doctoral también se han preparado glicodendrones de manosa y fucosa funcionalizados con un marcador fluorescente (derivado del BODIPY) para poder analizar los procesos de internalización y señalización celular mediados por el receptor DC-SIGN en células dendríticas. En estos ensayos, se ha demostrado que dichos glicodendrones se internalizan eficientemente de modo dependiente de esta lectina aunque no dan lugar a procesos de maduración de las células dendríticas, ni indujeron un cambio del tipo respuesta inmunitaria. Se puede concluir por tanto, que este tipo de sistemas es atractivo para su empleo como agentes transportadores de moléculas de interés en células dendríticas.