Transducción de señales en linfocitos. Implicación de la calcineurina y activación a través de antígenos de superficie (CD69)

Abstract

El conocimiento de la respuesta inmune como sistema de defensa frente a la invasión de organismos extraños ha alcanzado en los últimos años un alto nivel. El sistema inmune además de significar un elemento esencial en el sistema de defensa también ha sido tomado por gran número de investigadores como un modelo experimental para el estudio de multitud de procesos, tales como los mecanismos de proliferación, diferenciación y apoptosis celular. Descubrimientos de los últimos diez años han revelado que en las células del sistema inmune convergen, además de las clásicas rutas bioquímicas estudiadas en otras células somáticas, unos nuevos mecanismos tales como la síntesis y autorregulación por linfocinas altamente específicas. Hoy en día existen unas áreas de intensa investigación que se dirigen al descubrimiento de estas nuevas hormonas autocrinas, así como los mecanismos intracelulares que ellas ponen en marcha. Otros estudios se dirigen hacia el análisis de los mecanismos nucleares que, regulados por factores de transcripción, son puestos en marcha por acción de estas citoquinas. Así pues, se puede hoy en día dibujar un esquema altamente complejo en el cual las citoquinas y otros factores hormonales clásicos inciden sobre las células del sistema inmune y conducen a su destrucción, a su proliferación o a la síntesis de nuevos factores que van a interaccionar con las células vecinas. Todos estos procesos conllevan a cambios en lo que se conoce hoy en día como transducción de señales. En un sentido amplio podríamos definirla como el conjunto de modificaciones en proteínas, derivados de ácidos grasos, y otros segundos mensajeros, que finalmente pueden converger en el núcleo a través de señales (tales como factores de transcripción), induciendo o reprimiendo la transcripción de genes específicos.

En nuestra investigación, objeto de esta Tesis Doctoral, hemos intentado analizar de forma muy específica algunas de estas señales. En primer lugar nos referimos a estudios centrados en el papel de la calcineurina en del p53 y del NFKβ cuando se une al promotor HVI-1 LTR. Hay que resaltar que la calcineurina, una enzima descubierta a principios de los años setenta como una fosfatasa dependiente del calcio y la calmodulina, se considera hoy en día como una etapa central en la regulación de la actividad de muchos factores de transcripción. Esta función fue descubierta gracias a estudios realizados con la ciclosporina. A esta molécula, actuando como inmunosupresor no citotóxica, es capaz de enlazar con su receptor citoplasmático, una proteína llamada ciclofilina; y el complejo activo de ambos inhibe la actividad calcineurina. Este enzima fosfatasa (serina/treonina fosfatasa) no inhibible por acción del ácido okadaico, participa en la activación del NFAT defosforilándolo y permitiendo su traslocación al núcleo. Allí en conjunción con los factores c-Fos y C-Jun se une a la región promotora de genes muy específicos (IL-2) induciendo su transducción. Descubrimientos recientes han puesto de manifiesto que la calcineurina se encuentra también en el núcleo en donde defosforila a factores específicos en contraposición a otras cinasas que utilizan como substractos a estos factores.

Otra línea de investigación que hemos seguido trataba de analizar la función de la calmodulina en estos procesos. Por problemas metodológicos centrados en la unión débil de la calmodulina a las membranas usadas para la transferencia, estos estudios han quedado relegados a la espera de unas soluciones técnicas. Presentamos como trabajo tanto la producción y purificación de anticuerpos policlonales anti CaM, así como una metodología tendente a la mejora técnica del inmunoblotting con anti CaM. También presentamos un método alternativo al inmunoblot para la detección de la CaM usando técnicas de marcaje de proteínas con I125. Estos problemas han sido parcialmente resueltos gracias a la donación de anticuerpos monoclonales anti CaM, los cuales detectan la CaM con más sensibilidad que lo hacía nuestro anticuerpo policlonal.

Por último, presentamos como materia de esta Tesis Doctoral un trabajo realizado en colaboración con el Departamento de Inmunología del Hospital de la Princesa de Madrid en el cual se investigan las señales de transducción implicadas en la capacidad mitogénica de un anticuerpo dirigido contra una proteína de la superficie de los linfocitos denominada CD69. Aunque no se conoce el ligando fisiológico de este receptor, la estimulación con mAb contra esta proteína induce la activación de linfocitos T. hemos estudiado la fosforilación en tirosina del p56lck, así como la modulación de su actividad.

Es nuestro objetivo continuar este tipo de análisis incluyendo la participación de la calcineurina, ya que como se describe en el trabajo la CsA inhibe tanto la fosforilación en tirosina como la disociación del p56lck en una forma más lenta (p60lck).

En resumen también además de los trabajos referidos, se describen una serie de técnicas que hemos utilizando a lo largo del período de este período de formación y que incluye tanto la purificación de proteínas, producción de anticuerpos, técnicas de electroforesis y medida de actividades enzimáticas.