Nitrato reductasa asimilatoria de la bacteria acinetobacter calcoaceticus

Abstract

La atmósfera actual de la tierra es muy oxidante pues contiene un 21% de oxígeno. Esto hace que una gran cantidad de elementos se encuentren en forma de compuestos oxidados tales como: silicatos, sulfatos, fosfatos, nitratos, carbonatos, etc. cuando un organismo necesita utilizar cualquiera de estos elementos como fuente para la síntesis de sus distintos componentes celulares, requiere reducirlos previamente a un estado de valencia utilizable. En el caso de los organismos que asimilan nitrógeno nítrico, la reduccón de nitrato a amoniaco, utilizable ya directamente para la síntesis del material celular nitrogenado, se realiza en dos pasos enzimáticos bastante bien caracterizados: 1) el nitrato se reduce a nitrito en una reacción catalizada por la nitrato reductasa (cambio de valencia del nitrógeno de +5 a +3); 2) el nitrito resultante se reduce a amoniaco, mediante una reacción en la que interviene el enzima nitrito reductasa (cambio de valencia del nitrógeno de +3 a -3). La reducción de nitrato hasta amoniaco se ha estudiado a fondo en plantas superiores y algas verdes habiéndose caracterizado los enzimas que participan en el proceso, así como su mecanismo de regulación. En ciertas levaduras y hongos, la asimilación del nitrógeno nítrico sigue esencialmente los mismos pasos enzimáticos encontrados en plantas superiores y algas, y los requerimientos básicos de donadores de electrones, cofactores y metales así como su mecanismo de regulación resultan ser notablemente similares. En el caso de los procariontes, a excepción de unos cuantos organismos bien caracterizados, el proceso de reducción de nitrato no está tan bien estudiado y sólo se posee una información fragmentaria. Las bacterias utilizan el nitrato de dos maneras diferentes. Ciertos microorganismos bacterianos no fotosintéticos, son capaces de llevar a cabo una reducción desasimilativa del nitrato, también conocida como respiración de nitrato. En estas bacterias, el nitrato se reduce a nitrito, actuando aquel, en lugar del O2, como último aceptor de la cadena de transporte de electrones respiratoria. El nitrito producido se transforma generalmente en distintos compuestos nitrogenados (NO, N2O, N2) produciéndose así un empobrecimiento del contenido en nitrógeno en los ambientes donde viven estos microorganismos que por ello se denominan desnitrificantes. Al parecer, en este proceso participan entre el reductor y el sustrato aceptor último, unos transportadores de electrones similares a los de la cadena de transporte mitocondrial (flavoproteínas, quinonas, citocromos, etc.) así como ciertos metales susceptibles de experimentar reacciones redox reversibles. El enzima que interviene en la reducción de nitrato a nitrito como (último eslabón de la cadena de transporte respiratoria bacteriana, también llamada nitrato reductasa respiratoria, ha sido caracterizada en E. coli K-12, Micrococcus denitrificans y Micrococcus halodenitrificans. Se trata de un enzima asociado a membranas, de alto peso molecular y que contiene molibdeno, hierro no hemínico y grupos sulfuro lábiles, que al parecer son indispensables para la función catalítica de la proteína. Otro, tipo de reducción de nitrato operado por las bacterias es el de la reducción asimilativa, mediante el cual, el nitrato es reducido a nitrito en un primer paso, y en una ulterior reducción convertido en amoniaco. El enzima que participa en el primer paso del proceso, llamada nitrato reductasa asimilatoria ha sido caracterizada recientemente en algunos procariontes. En general, en estos organismos el enzima se encuentra asociado a partículas y la ferredoxina reducida es el donador inmediato de electrones en la reducción de nitrato a nitrito y sólo en unos cuantos casos en ciertas condiciones parece ser que el NADH actúa como donador en el proceso lo cual contrasta con los requerimiento del complejo nitrato reductasa de algas verdes, plantas superiores, hongos y levaduras que dependen exclusivamente de NAD(P)H. los viológenos reducidos sustituyen eficazmente a la ferredoxina y el enzima no parece requerir FAD para su actividad. Por el contrario la nitrato reductasa del grupo de organismos antes mencionado es un complejo enzimático de alto peso molecular que contiene flavina, molibdeno y citocromo b, y con dos actividades que actúan secuencialmente, entre el donador de electrones primario y el nitrato. La nitrato reductasa asimilatoria de procariontes no fotosintéticos ha sido menos estudiada. Hasta muy recientemente se sabía que este enzima, a diferencia de la nitrato reductasa respiratoria, no estaba asociada a membranas, no reducía clorato o bromato además del nitrato, y eran insensibles al tratamiento con azida. En nuestro laboratorio, se ha aislado y caracterizado la nitrato reductasa asimilatoria de Azotobacter chroococcum. Es un enzima de peso molecular 100.000, que contiene molibdeno, utiliza la ferredoxina o los viológenos reducidos como donadores de electrones, puede existir en dos formas enzimáticas interconvertibles, activa e inactiva y cuya síntesis se reprime por amoniaco y se induce por nitrato. Últimamente se ha conseguido reducir el nitrato en dicha bacteria con NAD(P)H mediante diaforasas presentes en el microorganismo, capaces de transportar los electrones a los viológenos que, una vez reducidos, pueden llevar a cabo la reducción del nitrato en presencia de la nitrato reductasa. El objeto de este trabajo es la caracterización de la nitrato reductasa de la bacteria Acinetobacter calcoaceticus. Esta bacteria pertenece al amplio grupo de las Moraxellas, oxidasanegativa. Es un cocobacilo, Gran-negativo, quimioorganotrofo, aerobio estricto, incapaz de fijar nitrógeno o de reducción desasimilativa del nitrato que utiliza una amplia gama de compuestos orgánicos como fuente de carbono puede asimilar nitrato. Excepto la antedicha capacidad de reducir nitrato por estos organismos nada se conocía sobre el enzima nitrato reductasa. Los resultados que presentamos a continuación pueden resumirse en los siguientes puntos: 1) Aislamiento y caracterización de la nitrato reductasa de Acinetobacter calcoaceticus. 2) Purificación de la ferredoxina de Acinetobacter calcoaceticus y del papel de este transportador en el proceso de asimilación de nitrato en este organismo. 3) Aislamiento y caracterización de las diaforasas dependientes de NAD(P)H, presentes en esta bacteria y determinación de su posible participación en la asimilación de nitrato. Parte de este trabajo ha sido publicado y comunicado en varios congresos nacionales e internaciones. Algunos experimentos han sido presentados como parte de la Tesis de Licenciatura.