Optimización del uso del sistema CRISPR en Synechocystis sp. PCC 6803.

Abstract

Las cianobacterias son organismos procariotas fotoautótrofos de gran interés en la biotecnología y la biología sintética, debido a su capacidad de utilizar el CO2 atmosférico y la luz solar como únicas fuentes de carbono y de energía, respectivamente. Uno de los mecanismos más utilizados hoy en día para la modificación genética de cianobacterias es el sistema CRISPR-Cas, que permite realizar roturas de doble cadena dirigidas en el genoma de la bacteria. Estas roturas posteriormente se reparan mediante recombinación homóloga con un DNA molde, lo que permite insertar mutaciones puntuales o genes exógenos en el genoma del organismo. Sin embargo, estos sistemas presentan un problema: para su utilización, es necesario transformar las cianobacterias con plásmidos de muy gran tamaño, lo que dificulta la entrada del plásmido en la célula. En este trabajo, se han desarrollado dos estirpes de Synechocystis sp. PCC 6803, llamadas CPF1 y AsCas12f1, que presentan en su genoma genes que codifican para las proteínas Cas Cpf1 y AsCas12f1, respectivamente. Gracias a la presencia de estos genes en el genoma, no es necesario incluirlos en los plásmidos utilizados, lo que reduce en gran medida su tamaño. Además, se ha comprobado que la presencia de estos genes en el genoma de Synechocystis no provoca una alteración de la tasa de crecimiento. Finalmente, se han construido dos plásmidos que contienen RNAs guía para la proteína AsCas12f1, para comprobar la eficiencia de su sistema CRISPR-Cas. Estos RNA guía tienen insertados los genes lacZα y ccdB, con la intención de facilitar la selección de aquellos plásmidos que sustituyan estos insertos por secuencias diana. Sin embargo, aunque se ha demostrado que el sistema con lacZα funciona, el sistema con ccdB no ha dado los resultados esperados, ya que no se ha producido la muerte celular al inducir su expresión.