Posible papel diferencial de la autofagia en respuesta al estrés proteico en microglía y neuronas

Abstract

En esta tesis doctoral hemos afrontado el estudio de mecanismos implicados en el mantenimiento de la proteostasis en dos tipos diferentes de células del sistema nervioso: microglía y neuronas. Para ello, se ha usado un modelo de estrés proteotóxico basado en la acumulación de proteínas tras el bloqueo del proteasoma con MG132, un inhibidor reversible del proteasoma. Los resultados más relevantes muestran que, tanto los mecanismos implicados como la respuesta al estrés, son diferentes en los dos tipos celulares. Por una parte, el bloqueo del proteasoma induce un estrés celular que se manifiesta como estrés de retículo endoplasmático (RE), lo que provoca la activación de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR, por sus siglas en inglés). La UPR se trata de una respuesta homeostática, que trata de mitigar la situación de estrés y/o inducir la muerte celular por apoptosis cuando el daño resulta excesivo. Las neuronas muestran una activación de la UPR rápida, completa y eficiente, activándose especialmente la vía de IRE1-sXbp1 (con carácter de pro-supervivencia), que a su vez promueve una rápida recuperación de la homeostasis y bajos niveles de muerte celular. Por otra parte, la microglía presenta una activación de la UPR poco eficiente, especialmente de la vía IRE1-sXbp1, mientras que la vía de PERK-CHOP se activa de manera intensa y sostenida en el tiempo. Esta vía tiene un carácter pro-apoptótico, por lo que su activación en la microglía conlleva la apoptosis temprana y masiva de estas células. Otro elemento objeto de estudio durante este trabajo ha sido la relación funcional entre el proteasoma y la autofagia. Resulta esencial la cooperación entre ambos sistemas de degradación de proteínas para la supervivencia celular en un ambiente de estrés proteico, como ya ha sido demostrado por este grupo en estudios tanto in vitro como in vivo. En este caso, nuestros resultados muestran que las células microgliales tienen un mayor flujo autofágico basal que las neuronas. Sin embargo, en un contexto de estrés proteico, las neuronas presentan un rápido, aunque suave, aumento de este flujo que resulta suficiente para eliminar las proteínas poli-ubiquitinadas. Por el contrario, la microglía no es capaz de degradar las proteínas poli-ubiquitinadas, que se van acumulando a lo largo del tiempo, a pesar de que se produce un fuerte aumento del flujo autofágico de manera lenta. Esto nos lleva a pensar que la activación de la autofagia en la microglía no sucede como respuesta a la inhibición del proteasoma, sino frente a otro estímulo. Puesto que uno de los principales propósitos de la microglía es la fagocitosis, y teniendo encuenta que ciertos estudios indican que existe una contribución de la autofagia microglial a la degradación de los residuos de A, -sinucleína y mielina (característicos de las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y ELA, respectivamente) tras su inclusión en los fagosomas desde el medio extracelular, proponemos que el estímulo activador de la autofagia microglial es la autofagocitosis de las mismas células microgliales que están muriendo debido al estrés de RE que se ha mencionado previamente. Por último, también hemos estudiado el estado de activación de diferentes vías que podrían estar implicadas en la activación de la autofagia. En general, nuestros datos muestran claramente que existen diferencias en el estado de activación de estas vías en ambos tipos celulares. Por un lado, la vía de mTORC1 se encuentra activa en las neuronas a lo largo de todo el tiempo ensayado, lo cual es compatible con una actividad autofágica continuada, mientras que en la microglía esta activación aparece retrasada en el tiempo y es de corta duración, lo que concuerda con el comportamiento de la autofagia en estas células. Además de esto, la vía AKT/GSK-3/-catenina también muestra un comportamiento diferencial. En las neuronas, AKT parece estar activado por la vía PI3K/PDK1, mientras que en la microglía esta vía se encuentra inhibida, siendo AKT activado en este caso por la vía mTORC2. Al estudiar el estado de fosforilación de AKT, encontramos que se encuentra fosforilado en distintos residuos dependiendo del tipo celular, lo que se asocia con una diferente selección de sustrato. De hecho, aunque AKT está activa en ambos tipos celulares, GSK-3 se encuentra activa en la microglía a lo largo de todo el tiempo ensayado, mientras que en las neuronas se encuentra inhibida de manera temporal, al tiempo que FOXO3 se mantiene activo en las neuronas y se inhibe en la microglía. Por último, la proteína -catenina (efectora de la vía Wnt/-catenina) también muestra comportamientos diferentes en función del tipo celular. En las neuronas no se detecta activación de esta vía, lo que nos lleva a pensar que la -catenina se está degradando a través de la autofagia. Por el contrario, en la microglía se produce una acumulación tiempo dependiente de esta proteína, lo que sugiere que se está dando la activación canónica de la vía Wnt/-catenina. Además, esta vía es capaz de modular la autofagia, por lo que podemos estar observando un mecanismo regulador de la autofagia respecto al material a degradar. En su conjunto, los datos obtenidos a lo largo de este trabajo se pueden interpretar desde un punto de vista evolutivo en cuanto a que las neuronas son células post-mitóticas, diferenciadas y sin capacidad proliferativa. Por ello, resulta razonable que las vías activas se centren en la degradación del material intracelular acumulado, mejorando así los niveles de estrés y permitiendo la supervivencia neuronal. Por su parte, las células microgliales presentan capacidad proliferativa, y su función es la de vigilar el medio extracelular, eliminando los agentes patógenos o citotóxicos del parénquima cerebral. De esta forma, resulta probable que los esfuerzos en estas células se centren en degradar el material extracelular capturado por fagocitosis, dejando en un segundo plano la supervivencia celular. Nuestros resultados son compatibles con estudios en pacientes de la enfermedad de Alzheimer donde se observa degeneración microglial, la cual es paralela al avance de los estadios Braak de esta patología. En resumen, nuestros resultados ponen de manifiesto diferencias significativas tanto a nivel molecular como funcional entre la microglía y las neuronas en respuesta al estrés proteico. En concreto, la función de la autofagia es diferente en ambas líneas celulares, así como la activación de diversas vías de señalización que pudieran estar regulando esta diferencia funcional. Además, este trabajo deja abierta diversas líneas de investigación, tales como determinar de manera exacta la/s vía/s de señalización de la activación de la autofagia en ambos tipos celulares en respuesta al estrés proteico, o evaluar el papel de la proteína quinasa AKT en la regulación de la autofagia canónica y no canónica.