Papel de las fibrilinas en la defensa de la planta modelo Arabidopsis thaliana frente a estreses abióticos

Abstract

El genoma de Arabidopsis codifica para 14 fibrilinas (FBNs). Estas 14 proteínas van aproximadamente desde los 21 a los 42 kDa de masa molecular. Su hidrofobicidad y sus puntos isoeléctricos concuerdan con su localización intracloroplástica. Siete de estas proteínas se encuentran principalmente en los plastoglóbulos (PGs) (FBN1a, FBN1b, FBN2, FBN4, FBN7a, FBN7b, FBN8). El resto de la familia se localiza en el estroma (FBN5) o en las membranas plastídicas (FBN3a, FBN3b, FBN6, FBN9, FBN10, FBN11), probablemente en los tilacoides. Los PGs son partículas lipoproteicas rodeadas por una monocapa lipídica y que están presentes en los plastos de la mayoría de tejidos vegetales fotosintéticos y no fotosintéticos. En los cloroplastos de plantas superiores se consideran continuaciones de la capa externa de la bicapa lipídica de la membrana tilacoidal (MT), facilitando así el intercambio de metabolitos hidrófobos entre la MT y los PGs. En un principio se pensó que tenían un papel exclusivamente de reserva de lípidos, pero datos posteriores indicaron que podían también participar en el transporte de metabolitos, en estrés, en senescencia o en el desarrollo e incluso relacionarse con elementos del ciclo de Calvin-Benson-Bassham. Estudios filogenéticos muestran que FBN1a, FBN1b y FBN2 forman una subfamilia o subgrupo. Las FBNs del subgrupo 1-2 han sido las más estudiadas hasta la fecha. Sin embargo, no se ha descrito ningún mecanismo por el que estas proteínas llevarían a cabo sus funciones. Hemos analizado la localización de FBN2 y hemos comprobado que se encuentra tanto en los PGs como en el estroma del cloroplasto. Al analizar la presencia de FBN2 en las diferentes fracciones de MTs observamos que, además de estar en los PGs, se localiza también en otras zonas de las MTs coincidiendo con el fotosistema II (PSII). Al eliminar las FBN1s y/o FBN2, en los distintos mutantes “knock out” (KO) la acumulación de antocianinas inducida por alta intensidad lumínica se ve ralentizada. Comprobamos que esta alteración se revierte tras la adición de jasmonato. Este hecho se relaciona con los resultados obtenidos en diferentes ensayos de coinmunoprecipitación (Co-IP), donde observamos que FBN2 interacciona con las enzimas que catalizan los primeros pasos de la biosíntesis de ácido jasmónico en el cloroplasto: LOX2, AOS y AOC. Estas interacciones han sido corroboradas mediante ensayos de complementación bimolecular de la fluorescencia (BiFC), mediante los que también se ha visto que AOS interacciona con las FBN1s. Toda esta información sugiere que FBN2 y las FBN1s mediarían la asociación de estas enzimas con los PGs, facilitando así el flujo de metabolitos a través de ellos. Observamos también la aparición de tejido necrótico en hojas completamente desarrolladas en los mutantes del subgrupo 1-2, siendo este más abundante en el mutante triple. El análisis de los parámetros fotosintéticos del PSII mediante fluorimetría de amplitud de pulso modulada (PAM) en estas hojas en plantas mutantes y silvestres cuando son expuestas a un estrés conjunto de alta intensidad lumínica y baja temperatura (ALF) indica que el valor del rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/Fm) es más bajo en las plantas mutantes, sobre todo en el mutante triple. Como consecuencia de la baja eficiencia del PSII, analizamos los niveles de peroxidación lipídica mediante el análisis de la formación de MDA. Los niveles de MDA fueron más altos en las líneas mutantes (siendo más altos en el mutante triple) al compararlos con los niveles de plantas WT, apoyando la idea de que la aparición de tejido necrótico es una causa de la formación de ROS. El número de PGs por cloroplasto varía en función de las condiciones ambientales o nutritivas de la planta. El número de PGs en los distintos mutantes KO de las FBNs 1-4 en condiciones de estrés por ALF es significativamente menor que el obtenido en plantas WT. También es significativamente menor el número de PGs en condiciones normales de crecimiento en los distintos mutantes KO del gen FBN2. Aunque parece que todas las FBNs relacionadas con este análisis son importantes para establecer el número correcto de PGs por cloroplasto, FBN2 parece tener un papel central en este proceso debido a que la eliminación de la misma provoca que no se alcance el número correcto de estos suborgánulos. Parece existir cierta redundancia de función con los genes FBN1s y FBN4, lo que explicaría el fenotipo aún más marcado del mutante KO de FBN1-4. Estos resultados indican que la eliminación de estas cuatro FBNs (las más abundantes asociadas a los PGs) no impide la formación de estos suborgánulos, lo que relativiza el papel de estas proteínas en la formación y mantenimiento de la estructura de los PGs. Por último, se ha iniciado la caracterización funcional de la proteína de función desconocida “Acclimation of Photosynthesis to Environment 1” (APE1), otra de las proteínas encontradas como interactora de FBN2 mediante los ensayos de Co-IP. Hemos podido estudiar que esta proteína está presente exclusivamente en los organismos fotosintéticos, desde cianobacterias hasta plantas superiores, mostrando un alto grado de conservación y que, en el caso de Arabidopsis, APE1 está presente en una sola copia, sin isoformas o genes con secuencia similar. Por otro lado, hemos observado que los estudios de localización de esta proteína indican que esta se encuentra distribuida uniformemente en las MTs.