Nanopartículas poliméricas para vehiculizar activos farmacéuticos al sistema nervioso central.

Abstract

Actualmente, la nanotecnología se ha convertido en una ciencia emergente, ofreciendo la posibilidad de desarrollar productos novedosos y numerosas aplicaciones para varios campos como la industria alimentaria, cosmética o de ingeniería. En este sentido, la nanomedicina es una alternativa innovadora enfocada en la mejora de las terapias tradicionales, una herramienta útil para resolver numerosos inconvenientes farmacocinéticos y farmacodinámicos de los tratamientos convencionales y que puede controlar el comportamiento fisicoquímico y biofarmacéutico. Específicamente, las nanopartículas poliméricas (NPs) se utilizan ampliamente como sistema de transporte de fármacos a escala nanométrica y presentan varias ventajas en comparación con las formas farmacéuticas tradicionales. Por otro lado, el tratamiento de diferentes enfermedades que afectan al cerebro resulta muy difícil debido a la presencia de barrera hematoencefálica (BHE). Esta barrera restringe el paso de sustancias tóxicas y virus que pueden ser perjudiciales para el sistema nervioso central, pero, desafortunadamente, también impide qu los activos terapéuticos puedan atravesarlo, lo que impide un tratamiento eficaz de los trastornos neuronales. Específicamente, la depresión es un importante problema de salud internacional; afectando a millones de personas en todo el mundo ya que ningún medicamento proporciona beneficio terapéutico a aproximadamente un tercio de los pacientes deprimidos. Con la predicción de que la depresión se convertirá en la principal carga mundial de enfermedades para el año 2030, es imperativo que se establezcan nuevas intervenciones terapéuticas. En el presente trabajo usamos venlafaxina (VLX) como modelo de fármaco antidepresivo. Por lo tanto, el objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido el desarrollo de un sistema polimérico biodegradable y biocompatible en escala nanométrica para mejorar el suministro de fármacos en el Sistema Nervioso Central que está limitado por la presencia de la BHE utilizando un antidepresivo de doble acción como fármaco modelo. En primer lugar, desarrollamos un nanosistema polimérico cargado con VLX basado en poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), un polímero biocompatible y biodegradable aprobado por la Food and Drug Administration (FDA). Las partículas se funcionalizaron superficialmente con dos ligandos diferentes contra el receptor de transferrina: transferrina y péptido específico para este receptor. Las partículas se prepararon usando un método de evaporación del disolvente de una doble emulsión y se funcionalizaron empleando la estrategia de carbodiimida. Las NPs no funcionalizadas y funcionalizadas se evaluaron y caracterizaron para determinar el tamaño de partícula y la distribución de tamaños, el potencial zeta y la morfología. La eficacia de la encapsulación se calculó mediante un método de HPLC validado y se estimó la eficacia de la conjugación usando un kit de BCA. Para determinar el perfil de liberación, se realizó un ensayo de liberación de fármaco in vitro y se analizó la estabilidad de las nanopartículas después de la incubación en líquido cefalorraquídeo artificial y después del proceso de liofilización. Para el estudio de citotoxicidad in vitro, se llevó a cabo un ensayo colorimétrico para cuantificar la viabilidad celular después de la incubación con NPs. La captación celular de NPs poliméricas se evaluó mediante estudios cualitativos y cuantitativos. Para el análisis cuantitativo, se utilizó microscopía confocal de barrido, mientras que la determinación cualitativa se realizó mediante citometría de flujo. Para visualizar NPs, éstas se cargaron con un fluoróforo (Nile Red) y los núcleos se tiñeron con Hoechst® 33342. Para el estudio de la permeabilidad a través de la barrera hematoencefálica, se desarrolló un modelo in vitro, empleando nanopartículas de FITC-PLGA para este fin. La permeabilidad del fármaco se evaluó mediante un método doble de cromatografía líquida de ultra alta presión/espectrometría de masas (UHPLC-MS/MS) y la permeabilidad de las NPS se estimó en base a la fluorescencia detectada en el lado basolateral. Para todos los estudios celulares, se utilizó la línea de células endoteliales microvasculares cerebrales humanas inmortalizadas (hCMEC/D3). En cuanto a los estudios in vivo, se evaluó la capacidad de las NPs para cruzar la BHE. Para esto, se administraron ratones C57/bl6 por vía intravenosa durante 7 días para administración crónica y con dos concentraciones de partículas diferentes para dosis aguda. Se recogió el cerebro y el bazo para cuantificar la fluorescencia mediante microscopía confocal y citometría de flujo. Los estudios de biodistribución in vivo se realizaron usando ratones C57/bl6. Para esto, se administraron por vía intranasal NPs fluorescentes con FITC encapsulado como fluoróforo y, después de 30 minutos, se recogieron el bazo, el cerebro, el corazón, los pulmones, el hígado y los riñones y se analizaron mediante citometría de flujo. El porcentaje de partículas detectadas se expresó como la relación de la unidad de fluorescencia de cada tejido con respecto a la suma de unidades de fluorescencia de todo el tejido analizado y se comparó la fluorescencia de cada órgano del grupo de tratamiento con la fluorescencia del grupo de control.