Degradación de clorofilas y carotenoides durante la elaboración de aceitunas verdes de mesa

Abstract

Los pigmentos responsables del color en los tejidos verdes de las plantas superiores son los llamados fotosintéticos o cloroplásticos. Se encuentran localizados en los llamados plastidios, que son diferenciaciones del protoplasma típicamente vegetal, separados del resto del citoplasma por membranas propias y que con frecuencia son portadores de pigmentos, como clorofilas y carotenoides, en cuyo caso se denominan cromatóforos (Strasburger et al., 1970). El pigmento más importante que interviene en la fotosíntesis, la clorofila, se encuentra en todos los cromatóforos fotosintéticamente activos, incluidos en una masa fundamental, el estroma, incolora y rica en lipoides. Los plastidios que debido a su gran contenido en clorofila presentan color verde, se llaman cloroplastos. En ellos también se hallan siempre, al lado de las clorofilas verdes, carotenoides liposolubles rojo-anaranjados y amarillos, en general, en menor cantidad. Las coloraciones amarillas y anaranjadas que suelen mostrar las flores, así como el rojo brillante de muchos frutos, son producidas, al menos en parte, por cromoplastos que son cromatóforos fotosintéticamente inactivos, que se desarrollan inmediatamente a partir de los protoplastidios incoloros o proceden por pérdida de la clorofila de cloroplastos verdes. El color de los cromoplastos se debe a su contenido en carotenos y xantofilas, semejantes e incluso idénticos a los carotenoides de los cloroplastos verdes. No es fácil definir, como incide el envejecimiento de la planta sobre los pigmentos. Se pueden ciertamente describir una secuencia de transformaciones en la maduración de los frutos, cuyo crecimiento se combina con cambios en el sabor, textura, color, etc. Sin embargo, antes de llegar al estado de madurez muchos frutos han quedado libres de clorofilas y los cloroplastos han sido reemplazados por los cromoplastos. La degradación de clorofilas durante la biosíntesis de carotenoides y/o antocianinas y betalainas es un fenómeno complicado. En muchos de ellos, al acercarse la maduración hay un estado en el cual, los cambios bioquímicos se inician por la producción autocatalítica de etileno. Este incremento de respiración marca el cambio entre desarrollo y maduración, produciéndose entonces la variación de coloración en la piel (Bauernfeind et al., 1971). La importancia de la clorofila en la tecnología de alimentos radica, no en su papel fotosintético, sino principalmente en su participación en la coloración verde, de frutos y vegetales. Los cambios que experimentan los pigmentos presentes en vegetales, durante las etapas de maduración y almacenamiento, o como consecuencia de los procesos de congelación, escaldado, deshidratación, etc. a que tienen que someterse para la mejor conservación de sus propiedades alimenticias y organolépticas, tienen una considerable repercusión en el color del producto final. Factores tales como temperaturas, pH, tiempo, acción enzimática, oxígeno y luz pueden ser causa de la degradación de este atributo. En general en la elaboración y manipulación de productos naturales como son los frutos y vegetales, que tras su recolección permanecen todavía vivos en múltiples aspectos, se pueden presentar, y de hecho se presentan, problemas cuyas causas, a veces son difíciles de determinar, ya que sus tejidos, metabólicamente activos, se encuentran sometidos a constantes cambios en su composición. Procesos físico-químicos, enzimáticos y microbiológicos pueden alterar notablemente las características de los mismos en el periodo que transcurre hasta su consumo, dependiendo de las transformaciones tecnológicas a las que se sometan y de las necesidades económicas, de transporte, almacenamiento, etc. que imponga el mercado. Teniendo en cuanta que España es un país eminentemente agrícola y que en algunos sectores es potencia de primer orden, toda la investigación dirigida a conocer con detalle la evolución de los distintos componentes presentes tanto en frutos como en vegetales, permitirá una adecuada selección de la materia prima así como un mejor control en la fabricación, y por consiguiente, en el mantenimiento de la calidad que exija el mercado. Por otro lado, la demanda del producto español a nivel internacional, es variable con el tiempo en relación a preferencia, tipo de elaboración, e incluso composición del producto final, según la diversificación de mercados que progresivamente se va alcanzado, y por el cambio de requerimientos nutricionales y características organolépticas. Uno de los sectores más representativos de nuestra producción agrícola es el del olivar, al que se dedican unos dos millones de hectáreas, aproximadamente un 10% de la superficie total cultivada en España. Andalucía, con un 50% de esa cantidad, es la región más importante en este sentido (Fernández Díez et al., 1985). En cuanto a la producción anual media de aceitunas ha venido incrementándose a partir de 1950, alcanzando en la actualidad cifras próximas a los dos millones de toneladas métricas. Este aumento se ha producido, esencialmente, por una mejora en los rendimientos, ya que el número de olivos se ha mantenido prácticamente invariable desde entocnes. No cabe duda, que los datos anteriores suponen un peso específico muy importante dentro del campo agrícola e incluso en el marco de la economía nacional. Es por ello, que todos los esfuerzos que se realicen para mejorar la calidad de los productos derivados de la aceituna, serán una inversión rentable que ayudará a mantener y aumentar las vías de salida para el comercio interior y exterior. Más aún, con la entrada de España en el Mercado Común, se abren nuevas expectativas hacia el gran mercado europeo, en el cual se podrá tener una mayor libertad de intercambio, pero en el que también se exigirán unos determinados niveles de calidad. La aceituna, como todo producto vegetal presenta unas características agronómicas, físicas y químicas, definidas en lo sustancial, pero suficientemente variables en lo accidental según variedades, que deben tenerse muy en cuenta para su aprovechamiento integral como materia prima, ya que de estas diferencias depende fundamentalmente su comportamiento tecnológico. De todos es sabido que el olivo, Olea europea L, especie conocida y difundida de la familia de las oleáceas, se cultiva exclusivamente para el aprovechamiento de sus frutos, que empiezan a formarse después de la floración, en Mayo o Junio, y maduran al final del otoño. El fruto, que es la “oliva” o “aceituna”, es una drupa verde, carnosa y comestible, que durante la maduración se va oscureciendo hasta adquirir un tono púrpura negruzco, al mismo tiempo que aumenta su contenido en aceite. La utilización de los frutos del olivo como aceitunas de mesa se pierde en la antigüedad, correspondiendo la primera cita histórica a Columela que data del siglo primero de nuestra era, en el año 54. (Fernández Díez et al., 1985). En nuestro país, la investigación sobre el aderezo de aceitunas verdes estilo español o sevillano, se inició en el año 1947 por Rodríguez de la Borbolla et al. (1956). Gracias a la ardua labor de estos científicos se consiguió convertir en un proceso tecnológico regido por unas normas de control físico-químico y microbiológico, lo que hasta entonces en España, y más concretamente en Andalucía, había sido una práctica artesanal industrializada. Desde entonces mucho se ha investigado sobre el fruto del olivo. No obstante, si bien la tecnología moderna amplía cada vez más las posibilidades en el tratamiento de los alimentos, bien cierto es que se plantean a su vez nuevos problemas. El sistema tradicional de elaboración de aceitunas verdes de mesa al estilo español o sevillano, requiere que los frutos se recojan en el ciclo de maduración antes del envero, oscilando su coloración entre el verde claro y verde amarillento. La preparación de este tipo de aceitunas, implica un tratamiento de los frutos con hidróxido sódico y posterior acondicionamiento de los mismos en salmuera, en la que experimentan una fermentación láctica natural. El proceso completo tiene una duración aproximada de seis meses y el producto acabado posee unas características organolépticas que le han dado fama tanto a nivel nacional como internacional. Aunque el proceso tradicional de fermentación de aceitunas se ha sometido en los últimos años a una considerable y sustancial transformación, aún permanece el hecho característico de que la fermentación se inicie de una manera espontánea, lo cual deriva en una falta de control sobre la flora microbiana que se desarrolla, el constante peligro de alteraciones y la falta de homogeneidad en la calidad del producto final. Al ser el color un importante atributo de calidad, utilizado en la mayoría de las nomas alimentarias, desde hace unos años se ha dedicado especial atención al estudio de los pigmentos cloroplásticos presentes en los frutos del olivo (Mínguez-Mosquera y Garrido-Fernández, 1989), y a las transformaciones que, durante el procesamiento de los mismos como aceitunas de mesa (Mínguez-Mosquera et al., 1989) y aceite de oliva (Mínguez-Mosquera et al., 1991), experimenta clorofilas y carotenoides. El color aparente de un alimento en general es un factor determinante para su calidad ya que produce en el consumidor potencial la primera impresión de aceptación o rechazo. Teniendo en cuenta que el color de los frutos y vegetales es consecuencia directa de los pigmentos naturales que poseen, se hace necesario en cada caso particular la caracterización de los mismo, al objeto de poder controlar y solventar cualquier problema de alteración o adulteración, sobre todo en aquellos productos que deben ser manufacturados. Aún siendo este atributo de calidad uno de los criterios más empleados para las normalizaciones comerciales, hasta el momento, el fundamento químico de los cambios que se originan, no se ha estudiado a fondo. El presente trabajo trata de dilucidar el origen de las modificaciones ocurridas en los pigmentos durante las condiciones normales de elaboración de aceitunas verdes de mesa. OBJETIVOS: El primer objetivo consiste en confirmar que la degradación de pigmentos cloroplásticos ocurrida en el fruto del olivo durante su elaboración como aceitunas de mesa se ajusta siempre a un mismo patrón. Con tal fin en el presente estudio se controla la evolución cualitativa y cuantitativa de los pigmentos presentes en frutos procedentes de ocho fermentadores. Así mismo se comprueba si las modificaciones incluidas en las distintas fases del proceso, ya sea en el tratamiento alcalino o en la fase de fermentación, influyen de alguna forma en esta degradación de pigmentos. El segundo objetivo radica en dilucidar el origen de los cambios estructurales ocurridos en las moléculas de clorofilas y carotenoides con la finalidad de poder establecer el mecanismo de degradación sucedido. En primer término se trata de clarificar si la formación de clorofilidas es de origen enzimático o consecuencia de una hidrólisis química. Una vez confirmado que estos componentes no se forman “in vitro” en el laboratorio, el estudio se orienta a la detección y caracterización de clorofilasa en aceitunas, enzima que hidroliza el éster fitol de las clorofilas. Dada la dificultad de extracción de este enzima en la aceituna, se utilizan los frutos como fuente de enzima y de sustrato y el producto de la reacción enzimática se controla por CLAR. Paralelamente se confirma que el resto de transformaciones estructurales ocurridas en los pigmentos son debidas al pH ácido del medio y se estudia la incidencia del proceso fermentativo sobre la transformación cis-trans β-caroteno. El conocimiento del origen, tanto químico como enzimático, de todas estas transformaciones permitirá establecer el mecanismo de degradación ocurrido, y realizar el estudio cinético de cada una de las etapas elementales que describan cambios estructurales identificables. Por último, en frutos elaborados como aceitunas verdes de mesa al estilo Español o Sevillano y procedentes de la industria, se caracteriza el valor de provitamina A así como el posible efecto negativo de los derivados clorofílicos defitilados. CONCLUSIONES: 1. El cambio de color que experimentan los frutos durante el proceso de elaboración de aceitunas verdes de mesa se debe exclusivamente a la modificación estructural de pigmentos, que ya sea por vía química o biológica origina en el producto final una composición análoga de pigmentos. Las clorofilas inicialmente presentes en el fruto fresco experimentan una total transformación, originando en el producto final una mezcla de feofitinas y feoforbidas. En la fracción carotenoide β-caroteno y luteína permanecen inalterados mientras que el resto de componentes, con grupos 5,6-epóxidos en su moléculas se degradan totalmente dando lugar a sus correspondientes derivados 5,8-furanoides. 2. La presencia de clorofilidas en los frutos durante los primeros días de la fermentación parece estar mediatizadas por la acción enzimática de clorofilasa. La inviabilidad de inducir la formación específica o exclusiva de derivados desesterificados por tratamiento químico de clorofilas es indicativo de que dicha transformación ha tenido lugar por vía enzimática. 3. La intervención de clorofilasa ha sido puesta de manifiesto mediante activación del enzima en el propio fruto. El control del alcance de la reacción se ha verificado por CLAR mediante la cuantificación simultánea del sustrato y el producto de la reacción. 4. Aunque como era de esperar la temperatura óptima de activación es 70ºC, se ha comprobado que la proporción de acetona en el medio de incubación favorece más la acción enzimática que el incremento de temperatura. Las condiciones óptimas de activación se consiguen incubando los frutos a 50ºC en la mezcla: tampón clorofilasa/acetona (1:1). 5. En las condiciones ensayadas, (activación de la reacción enzimática en el fruto), y al margen de que el sustrato sea de la serie “a” o “b”, el estudio de influencia del pH evidencia dos valores óptimos de actividad de clorofilasa, debidos a la existencia de dos sustratos en cada serie propiciados por el propio pH. Para clorofilas el máximo se encuentra a pH 7,5 y para feofitinas a pH inferior a 5 unidades. 6. Respecto a la especificidad por el sustrato, el enzima clorofilasa muestra actividad preferente sobre la serie “a” a valores de pH comprendidos entre 5,5 y 8,0, mientras que a valores superiores e inferiores a esto dos límites la afinidad es mayor por la serie “b”. 7. Durante el proceso de elaboración de aceitunas de mesa, al estar la formación de clorofilidas exclusivamente restringida a los tres primeros días de la colocación de los frutos en salmuera, la intervención del encima solo puede expresarse como actividad acumulada de clorofilasa. El pH claramente alcalino de los frutos, en este periodo previo a la implantación del proceso fermentativo, favorece que la acción de clorofilasa se preferente por clorofila “b”. La coincidencia de la inactivación del enzima con el equilibrio fruto-salmuera parece indicar que la concentración de sal puede jugar un papel inhibidor. 8. El balance de materia efectuado sobre la concentración total de pigmentos, se mantiene constante a lo largo de todo el proceso, lo cual evidencia que no ocurren reacciones de tipo oxidativo que rindieran finalmente productos incoloros. 9. La degradación de pigmentos promovida por ácido puede considerarse de pseudoorden, ya que la concentración de iones H+ con respecto a la de pigmentos se encuentra en exceso desde el inicio del proceso, pudiendo considerarla, por tanto, como constante. 10. En consecuencia con lo anterior, la degradación de pigmentos ocurre según dos mecanismos: a. Enzimático: La formación de clorofilidas parece estar mediatizada por la acción de clorofilasa en los días previos a la implantación del proceso fermentativo. b. Químico: La acidez, que progresivamente se desarrolla en el medio de fermentación, provoca la sustitución del ión Mg2+ por H+ en las moléculas de clorofilas y clorofilidas, ocasionando la formación de feoftinas y feoforbidas. Por la misma razón, en la fracción carotenoide únicamente experimentan transformación aquellos componentes que por su estructura molecular son sensibles al medio ácido. 11. En la degradación de clorofilas se contabilizan tres etapas elementales que se ajustan a cinéticas de primer orden con respecto a la concentración de cada pigmento. 12. a. La degradación de clorofilas a feoforbidas se ajusta a una reacción consecutiva en la que clorofilidas actúan como producto intermedio. En la serie “a”, el paso lento es la reacción en la que se encuentra implicado el enzima, ya que la constante de velocidad de formación de feoforbidas (k2a) es del orden de 3 veces superior a la constante cinética de formación de clorofilidas (k1a). En cambio, la elevada afinidad del enzima por clorofila “b” hace que, en este caso, el paso lento de la reacción global sea el que no está gobernado por el enzima sino por la concentración de H+, siendo la constante de velocidad de formación de feoforbida “b” (k2b) inferior a la de formación de clorofilida “b” (k1b). b. La degradación de clorofilas en feofitinas ocurre en paralelo con la reacción anterior. c. En la degradación promovida por ácido el paso a feoforbidas (k2) es más rápido que a feofitinas (k3) ya que clorofilida presenta una mayor tendencia a perder el ión Mg2+ que clorofila por su mayor solubilidad en agua. d. La mayor sensibilidad la serie “a” a perder el ión Mg se pone de manifiesto tanto en el paso de clorofilida a feoforbida, como en el de clorofila a feofitina, resultando las constantes cinéticas de la serie “a” dos veces superiores a las de la serie “b”. 14. La degradación de violaxanteno y neoxanteno ocurre en una única etapa elemental que sigue una cinética de primer orden con respecto a la concentración del pigmento. 15. En el proceso de elaboración denominada rápido parece seguir una mecánica de degradación de pigmentos más complicada, no permitiendo los resultados obtenidos hasta la fecha concluir un ajuste cinético. 16. Aunque la concentración de β-caroteno permanece constante durante el proceso de elaboración de aceitunas verdes de mesa, el valor de provitamina A experimenta una pérdida del 2,5% por isomería cis, rindiendo en el producto final 308,9 ± 27 U.I.. 17. El contenido medio en derivados clorofílicos defitilados en aceitunas de mesa comerciales dista de los límites máximos permitidos para evitar la dermatitis fotosensible.