Electrofisiología de células adrenocorticales: Estudio mediante el registro intracelular y la técnica de “patch clamp”

Abstract

El presente trabajo se centra en el estudio de las características electrofisiológicas de células adrenocorticales en cultivo como fase previa al análisis de la posible participación de los fenómenos eléctricos de la membrana en el proceso de acoplamiento estímulo-secreción. Como se ha expuesto en el apartado anterior (“Introducción”), el desarrollo de las técnicas electrofisiológicas en los últimos años ha favorecido el estudio de los mecanismos subyacentes a la regulación de la secreción celular desde un punto de vista biofísico y cuantitativo. Esta información junto a la ya obtenida con metodología bioquímica, está permitiendo un conocimiento más profundo y dando una visión más global de la fisiología de la secreción celular. De acuerdo con las ideas antes expuestas los objetivos del presente trabajo son los siguientes: Puesta a punto de las técnicas de registro intracelular y, especialmente, la de registro de corriente iónica transmembrana mediante la técnica de “patch clamp”, incluyendo el diseño y construcción del equipo electrónico de registro. Este objetivo lo consideramos de gran importancia, no solo porque aporta una independencia conceptual y metodológica que es de gran importancia en nuestro medio, sino porque además en la investigación biofísica actual el nivel de competitividad depende en gran medida de la posibilidad de desarrollo de tecnología propia. La preparación escogida (células adrenocorticales en cultivo) presenta así mismo gran interés ya que desde el punto de vista electrofisiológico es desconocida. Objetivos específicos: a) Registro del potencial de membrana en células adrenocorticales en cultivo y caracterización de las propiedades eléctricas pasivas de estas. b) Estudio de las características eléctricas activas y análisis de las conductancias iónicas de la membrana de células adrenocorticales. c) Registro de corrientes iónicas de la membrana a través de un solo canal con la técnica de “patch clamp”. d) Caracterización de los canales iónicos, con especial interés del canal de K+ activado por Ca2+ de gran conductancia. Este canal está bien estudiado en otros tipos de células pero se desconocía su presencia en células secretos de hormonas esteroides. CONCLUSIONES 1. En el presente trabajo se han estudiado las características electrofisiológicas y las conductancias iónicas de células adrenocorticales en cultivo. 2. Se han montado las técnicas de registro intracelular y de “patch clamp”, siendo una parte importante de este proyecto el diseño y la construcción del equipo electrónico de registro utilizado en el mismo. 3. Las células Y-1 tienen un potencial de membrana de -68±12,9 mV (n=63). En ningún caso se observó actividad eléctrica espontánea; sin embargo, en todos los registros la despolarización de la célula con pulsos cuadrados de corriente positiva dio lugar a la generación de potenciales de acción. 4. Los potenciales de acción de las células adrenocorticales Y-1 tienen un umbral de excitación alto (42,9±17 mV) una amplitud de 55-140 mV y una duración muy variable (6-300 ms). Estos potenciales de acción se caracterizan por tener una fase de subida lenta del orden de 18 V/s, una fase de meseta durante la cual se produce una repolarización lenta y cuya prolongación es la principal responsable del aumento de duración de los potenciales de acción, y una fase de repolarización del orden de 41 V/s que se continúa con una pequeña hiperpolarización. 5. Los potenciales de acción registrados en células adrenocorticales no se afectan en presencia de TTX o en una solución sin Na+ y se anulan cuando se sustituye el Ca2+ de la solución externa por Co2+, lo cual indica la existencia en estas células de una conductancia al Ca2+ dependiente del voltaje. 6. La sustitución del Ca2+ de la solución externa por Ba2+ da lugar a la aparición, tras la inyección de corriente despolarizante, de potenciales de acción de Ba2+ que se caracterizan por tener un umbral de excitación muy bajo, una fase de despolarización muy lenta seguida de otra más rápida y de una meseta que dura tanto como el pulso de corriente inyectada. Este hecho se debe a la mayor permeabilidad de los iones de Ba2+ a través de los canales de Ca2+. 7. La duración de los potenciales de acción de Ca2+ aumenta con estímulos prolongados o con pequeños incrementos en la cantidad de corriente inyectada. Este hecho se debe posiblemente a inactivación con voltajes positivos y alto Ca2+, de una conductancia al K+ dependiente de Ca2+, la cual parece participar en la repolarización de los potenciales de acción. 8. Mediante el registro de la corriente que fluye a través de canales iónicos incluidos en microáreas de membranas se han observado distintos tipos de canales de K+ en células Y-1. 9. El presente trabajo se ha centrado en la identificación y análisis de un canal de K+ de gran conducta (aproximadamente 182 pS en soluciones simétricas de 130 mM K+, n=29). Este canal se registró en el 99% de los parches de membrana aislados en el presente estudio, encontrándose generalmente de 1 a 5 canales por microárea de membrana (aproximadamente 1 µm2). 10. La activación del canal de K+ de gran conductancia se afecta por el voltaje aplicado a ambos lados de la membrana. En microáreas aisladas “in situ” y con soluciones fisiológicas en contacto con la superficie externa de la membrana la activación del canal, para pequeñas despolarizaciones, aumenta e veces por cada 7-10 mV de incremento del potencial de membrana. 11. La activación de este canal depende también de la concentración intracelular de Ca2+, pero es independiente de la concentración extracelular de este catión. El canal tiene una probabilidad de estar abierto, P(a), de 0,5 a -40mV de despolarización cuando la concentración de Ca2+, es de 2-3 µM; esta misma probabilidad se alcanza a -70 mV con 50 µM Ca2+. 12. El Ca2+, modula la activación del canal por el potencial de membrana. El canal es muy poco dependiente del voltaje con concentraciones extremas de Ca2+, (50 y 0,01 µM), pero presenta su máxima sensibilidad al voltaje con concentraciones de Ca2+, cercanas a las fisiológicas. 13. La conductancia del canal de K+ activado por Ca2+ no se modifica con variaciones en la concentración intracelular de Ca2+ (2-50 µM). La conductancia es lineal en soluciones simétricas de K+ (130 mM) aunque a voltajes extremos (±50 mV) se observa una disminución de la misma. 14. El canal de K+ activado por Ca2+ presenta una cinética compleja. En células Y-1 posee dos subestados de conductancia que representan el 25-35% y el 55% de la corriente a través del estado normal. Ambos estados pueden aparecer en un mismo canal. Pueden observarse que las aperturas y cierres de canal se distribuyen en forma de brotes, lo que hace sugerir que el canal posee más de un estado cerrado. En ocasiones se registraron periodos de inactivación durante los cuales el canal permaneció varios segundos cerrados; la vuelta a la actividad normal se produjo espontáneamente. 15. El canal de K+ activado por Ca2+ es muy selectivo para el K+ como lo demuestra la comparación de las curvas I/V procedentes de las observaciones experimentales con las obtenidas teóricamente según la ecuación de GHK para un canal 100 veces más selectivo al K+ que al Na+. 16. La corriente a través del canal de K+ activado por Ca2+ se afecta por los iones de Na+ presentes en las soluciones de registro. El Na+ tiene un efecto bloqueante sobre este canal cuya magnitud está en función del potencial de membrana. El Ca2+ parece tener un efecto similar. 17. Las células adrenocorticales son, por tanto, eléctricamente excitables y poseen conductancias al Ca2+ y al K+ activad por Ca2+. En estas células la secreción de hormonas esteroideas por estimulación con ACTH requiere la presencia de Ca2+ extracelular en el rango de mM. Las conductancias iónicas descritas en este trabajo son las que regulan la entrada de Ca2+ en la célula y en consecuencia desempeñan un papel importante en la regulación de la secreción.