Estudio comparativo de ácidos húmicos de vertisol extraídos con dos agentes alcalinos

Abstract

El solvente ideal de las S.H. sería igual que extrajera un gran porcentaje de material húmico inalterado. La bibliografía existente sobre estudios comparativos entre los distintos extractores disponibles es muy extensa: Bremner y Lees 1949, Wright y col. 1958, Martín y Reeve 1957, Choudrhi y Stevenson 1957, Schnitzer y col. 1959, Wiesemüller 1965, Schnitzer y Levesque 1966, Kononova 1966-1967, Posner 1966, Theng y col. 1967, Schnitzer y Skinner 1968, Lindquist 1968, Butler y Ladd 1969, Dormaar y col. 1970, Jacquin y col. 1970, Hernando y col. 1971. Sin embargo, el extractor ideal, no existe. Normalmente, en las conclusiones de los trabajos citados se señala que la naturaleza del agente extractor comporta variaciones en los rendimientos y en las propiedades de los A.H extraídos, debido a la distinta facilidad de aquellos para romper el complejo arcillo-húmico y por la modificación de los materiales que extraen. Como se estableció anteriormente, la naturaleza dinámica de la M.O. del suelo determina que en un momento dado se encuentran materiales en distintas etapas de humificación o descomposición. Porter 1967, sugirió que una extracción en serie de coloides del suelo, podía conducir a la obtención de un rango de fracciones con diferentes tamaños moleculares. Asimismo, Posner y col. 1968, consideran que diferentes extractos de M.O. del suelo pueden contener mezclas diferentes de A.H., en cuanto que estos se han formado de distintos materiales de partida. En el presente trabajo, se ha estudiado la influencia que dos agentes extractores alcalinos ejercen sobre la naturaleza de la fracción húmica de un mismo vertisol. La elección de os agentes extractores, mezcla pirofosfato-sosa y sosa, e hizo en razón de su mayor eficacia y de la universalidad de su aplicación. Mediante estudios de caracterización y degradación, se pretende establecer si los agentes extractores aíslan A.H. estructuralmente distintos o por el contrario solo difieren superficialmente en complejidad. En otras palabras, se tratará de comprobar si los A.H. extraídos son homogéneos y polidispersos en cuanto al P.M. o realmente en cada A.H. los componentes de las moléculas son químicamente diferentes. Con este fin se ha considerado importante describir e interpretar las diferencias que pueda haber entre fracciones de ambos A.H. al variar el tamaño y el P.M. Para ello se ha empleado molecularmente más homogéneos, diferentes en tamaño y forma: gel filtración sobre Sephadez. El estudio físico-químico de esas fracciones nos puede servir para aclarar si los A.H., son el resultado de la conjugación de un sistema de polímeros o forman una estructura homogénea macromolecular, y para comprobar que factores determinan las diferencias encontradas. Dada la importancia teórica y práctica que tiene, se calculará el P.M. –promedio ponderal de los A.H. extraídos con ambos agentes, y se relacionará con el grado de humificación y condensación de éstos. CONCLUSIONES 1. La mezcla pirofosfato-hidróxido sódico extrae 1,5 veces más carbono del suelo que el hidróxido sódico. El porcentaje en ácidos húmicos extraídos por ambos agentes es similar, pero no así el de ácidos fúlvicos, que es 2,5 veces mayor cuando se emplea la mezcla. La mezcla pirofosfato-hidróxido extrae, en menor tiempo y con menos manipulaciones, una mejor representación de las sustancias húmica presentes en el suelo. 2. El contenido en cenizas de los ácidos húmicos extraídos con ambos agentes es muy bajo: 1,2% para los extraídos con hidróxido sódico y 0,9% en los extraídos con la mezcla hidróxido-pirofosfato. El contenido en cationes mono, di y trivalente en las cenizas del extraído con hidróxido sódico es también mayor que el de los extraídos con la mezcla. Estos resultados indican: a) que el tratamiento de purificación seguido es efectivo para obtener muestras con “alto grado de pureza”, imprescindibles para una comparación inequívoca de características físico-químicas y b) que el tratamiento con ClH para reducir la unión de los ácidos húmicos con cationes metálicos y para romper sus enlaces con los minerales de la arcilla, para permitir una mayor efectividad de la extracción con hidróxido sódico, no es tan práctico a este fin como el realizar la extracción con la mezcla pirofosfato-hidróxido. En el tipo de suelo empleado en este trabajo, puede evitarse el lento proceso de decalcificación que requiere la extracción con hidróxido sódico, si se quiere obtener mayor cantidad de ácidos húmicos y más “puros” en cuanto al contenido en material inorgánico. 3. Los análisis de composición elemental de los ácidos húmicos extraídos con ambos agentes presentan valores semejantes, estando incluidos dentro de los límites señalados en la bibliografía para ácidos húmicos de vertisoles andaluces y dentro del intervalo conocido para otros tipos de suelos. Los ácidos húmicos extraídos con la mezcla hidróxido-pirofosfato tiene mayor contenido en Carbono y menor en Hidrógeno y Nitrógeno que los extraídos con hidróxido-sódico, siendo particularmente acusada la diferencia encontrada en el contenido en Nitrógeno (4,25% para el ácido húmico extraídos con hidróxido sódico y 2,14% para el extraídos con la mezcla que contiene pirofosfato). El mayor contenido en Nitrógeno del primero se debe a la co-extracción y posterior coprecipitación de sustancias nitrogenadas de naturaleza no húmica. Según los valores de las razones moleculares O/H y C/H, los ácidos húmicos extraídos con la mezcla pirofosfato-hidróxido sódico presentan mayor grado de oxidación y condensación molecular que los ácidos húmicos extraídos con la disolución del hidróxido. 4. La relación gráfico-estadística entre las razones atómicas H/C y O/C de las dos muestras, eliminando el porcentaje de C y O en grupos funcionales, revela que el ácido húmico extraído con hidróxido sódico es más parecido a la(s) lignina(s) que el extraído con la mezcla hidróxido-pirofosfato. El esqueleto del ácido húmico contenido en este último extracto corresponde a un anillo aromático con una unidad metilénica, en tanto que el del ácido húmico extraído con hidróxido sódico corresponde a un anillo aromático con una cadena alifática de cuatro átomos de carbono. 5. En ambos ácidos húmicos, la acidez total se debe principalmente al contenido en grupos COOH, ya que el contenido en OH fenólicos es bajo, aunque dentro del intervalo señalado anteriormente para ácidos húmicos de vertisoles. Este dato, confirmado por las curvas de valoración, contrasta con otras opiniones que señalan un importante papel de los OH fenólicos en el carácter ácido de los ácidos húmicos del suelo. Es de destacar el alto valor de OH alcohólicos encontrados para ambas muestras, superiores a los obtenidos por otros autores. Por otra parte, los valores de C=O totales están incluidos dentro de los existentes en la literatura. Todo esto indica que tanto la naturaleza del suelo como la del agente extractor condicionan la composición de grupos funcionales de las sustancias extraídas. 6. La distribución de oxígeno en grupos funcionales oxigenados, indica que un elevado % de dicho elemento, sobre todo en el ácido húmico extraído con hidróxido sódico (42%), se encuentra en forma de grupos funcionales no reactivos y/o en puentes etéreos. 7. El espectro de IR de ambas muestras refleja claramente las principales diferencias analíticas encontradas y el buen grado de pureza de los dos ácidos húmicos. La mayor intensidad de la banda a 2900 cm1- en los ácidos húmicos extraídos con hidróxido sódico, expresa un mayor contenido en C-H alifático. Para ambas muestras se observa una buena correlación lineal entre capacidad de cambio catiónico, contenido en COOH e intensidad de las absorciones a 1725 y 1220 cm-1. Las principales diferencias cualitativas entre los espectro de ambas muestras se observan en la región en que absorben la mayoría de los grupos C=O. El del ácido húmico extraído con hidróxido sódico presenta una banda ancha a 1660 cm-1, mientras que el espectro del ácido húmico extraído con la mezcla la presenta, mejor definida, a 1610 cm-1. El desplazamiento de la banda a 1660 cm-1 hasta 1600 cm-1 que se observa en los residuos de la hidrólisis y de la oxidación al aire de la muestra de ácido húmico extraído con hidróxido sódico, supone un cambio en los grupos C=O de libres o débilmente unidos por puentes de H a formas más fuertemente quelatadas. Por otra parte, la agudización de la banda a 1660 cm-1 en el espectro del ácido húmico del extracto con hidróxido sódico metilado con diazometano y la aparición de esta banda en el del ácido húmico extraído con la mezcla sometido al mismo tratamiento, revela probablemente la presencia de grupos C=O quinónicos libres. Estos resultados permiten asignar la banda a 1610 cm-1 a C=O cetónicos y/o quinónicos fuertemente unidos por puentes de Hidrógeno, además de a la vibración del anillo aromático; y la banda a 1660 cm-1 a absorción de grupos C=O libres (cetónicos y /o quinónicos) además de a la absorción de amidas. En el espectro del ácido húmico extraído con hidróxido sódico se observa a presencia de una banda a 1540 cm-1 que no presenta el ácido húmico extraído con la mezcla. De acuerdo con otros autores esta absorción se relaciona directamente con el mayor contenido en nitrógeno del ácido húmico del extracto con hidróxido, lo que se confirma por la total desaparición de la banda en el espectro del residuo de la hidrólisis con ClH 6N. 8. El espectro de UV-visible de ambas muestras no presenta máximos ni mínimos. De acuerdo con algunos investigadores, la mayor absorción de luz del ácido húmico extraído con la mezcla se relaciona directamente con el mayor contenido en nitrógeno no hidrolizable que tiene esta muestra. Diversas relaciones entre densidades óptica en esta zona del espectro (K14/K0, * 100; E4/E6; log K) indican una mayor estabilidad, humificación y condensación molecular o heterogeneidad en los ácidos húmicos extraídos con la mezcla pirofosfato-hidróxido sódico. 9. De acuerdo con el distinto comportamiento frente a los electrolitos, el ácido húmico extraído con la mezcla es algo menos hidrofílico que el extraído con hidróxido, lo que supone una mayor proporción de estructuras alifáticas en este último. La determinación experimental de la aromaticidad por oxidación al aire, indica que ambos ácidos húmicos son bastante aromáticos (C e H aromáticos del ácido húmico extraído con hidróxido sódico: 64 y 35%; y C e H aromáticos del extraído con la mezcla: 70 y 47% respectivamente), siéndolo en mayor proporción el ácido húmico extraído con la mezcla. 10. La hidrólisis ácida elimina las principales diferencias físico-químicas entre ambas muestras de ácidos húmicos, según se aprecia en los espectro de IR de los residuos hidrolizados y en los datos de análisis elemental y de grupos funcionales. Este resultado indica que las principales diferencias entre los ácidos húmicos de ambos extractos pueden atribuirse a grupos de sustancias no húmicas unidas al núcleo central de los ácidos húmicos. De los valores de las razones C/H y O/H, puede deducirse que el residuo de la hidrólisis está constituido en ambas muestras por material más condensado y en mayor estado de oxidación. El tratamiento con ClH 6N conduce a un incremento en grupos C=O totales bastante acusado. Este incremento puede interpretarse en el sentido de que la hidrólisis elimina materiales absorbidos o débilmente unidos, con lo que se hace posible la detección de características estructurales enmascaradas o estéricamente prohibidas. 11. Los fraccionamientos físicos por Gel Filtración sobre Sophadez y Electroforesis solo reducen ligeramente la polidispersidad de las muestras totales. El estudio químico y espectroscópico de las fracciones obtenidas por Sephadex indica que estas siguen siendo bastante complejas. La revisión efectuada sobre las técnicas de fraccionamiento comúnmente empleadas ha permitido aclarar algunos mecanismos de la interacción ácido húmico/gel, así como señalar que el fraccionamiento de las muestras en medio ácido eluyendo con agua destilada tienen lugar en virtud de exclusión molecular, además de tamaño molecular; y el de las muestras en medio neutro y eluidas con Tris de acuerdo con una relación de pesos moleculares. 12. Los espectro de UV-visible de las distintas fracciones obtenidas por Sephadex son, al igual que los de muestras totales, muy poco significativos. En desacuerdo con ideas bastante generalizadas, el peso molecular, tanto en las fracciones como en las muestras totales, está negativamente correlacionado con las densidades ópticas a lo largo de todo el espectro UV-visible. 13. El peso molecular promedio ponderal de las dos muestras totales calculado por un método combinado de Gel Filtación-Difusión resultó ser 54.800 para el ácido húmico extraído con la mezcla hidróxido-pirofosfato. 14. El estudio de los hidrolizados no indicó la existencia de diferencias cualitativas en cuanto a los productos identificados, pero sí la de diferencias cuantitativas, excepto en el contenido en hexosas totales. Se han identificado los aminoácidos: cistina, ácido aspártico, histidina, glicina, ácido glutárico, prolina, tirosina, valina, fenil alanina e isoleucina, y probablemente alanina, treonina y arginina; y los fenoles: ácido p-hidroxibenzonico y ácido siringico. Cuantitativamente, el ácido húmico extraído con hidróxido, tiene mayor proporción de ambos tipos de compuestos, de acuerdo con la mayor co-extracción de material no húmico anteriormente señalada. 15. En la degradación priolítica de ambas muestras se identificaron los mismos productos de bajo y alto punto de ebullición, aunque el ácido húmico extraído con hidróxido sódico los produce en mayor cantidad. El mayor rendimiento en productos de bajo punto de ebullición de este ácido húmico, puede deberse a su mayor contenido en cadenas alifáticas, como puentes de unión entre unidades aromáticas o como grupos CH3 directamente sustituidos al anillo. Este resultado apoyaría a los obtenidos por IR, diagrama H/C vs O/C, comportamiento frente a electrolitos, oxidación al aire y características del residuo hidrolizado. 16. Los pirogramas de los residuos de la hidrólisis en ambas muestras así como los residuos de oxidación al aire de las mismas son cualitativamente similares a los de las muestras originales, pero es mucho menor la altura de los picos, lo que comprueba, como se indicó en otro lugar, que la mayor parte de los productos de bajo punto de ebullición provienen de materiales alifáticos fácilmente hidrolizables y oxidables. 17. La separación por cromatografía de gases de la mezcla de productos obtenidos por oxidación con permanganato de ambas muestras metiladas, revela pocas diferencias cualitativas y cuantitativas. La más significativa es la presencia de ácidos alifáticos dicarboxílicos, entre los que se ha identificado el ácido subérico, como productos de oxidación del ácido húmico extraído con hidróxido sódico, lo que confirma la mayor presencia de cadenas alifáticas en dicho ácido húmico. 18. La similar composición y cantidad en ácidos bencenopolicarboxílicos obtenidos por la oxidación con MnO4K de ambas muestras, sugiere que tienen unidades estructurales básicas semejantes. 19. Los resultados indican que las muestras totales constituyen un sistema heterogéneos de polímeros húmicos que difieren de una a otra solo cuantitativamente. La explicación de este hecho puede encontrarse en la separación de los ácidos húmicos en fracciones definidas, cuando son absorbidos por los minerales de la arcilla y otros coloides del suelo. 20. Los métodos físico-químicos empleados actualmente para la caracterización de ácidos húmicos extraídos de un mismo suelo, no permiten revelar diferencias esenciales entre éstos, cuando se siguen similares criterios de extracción y purificación.