Resumen | OBJETIVOS
A la vista de la diversidad de factores y de las contraindicaciones encontrada en la bibliografía sobre la intervención de distintos factores en el desencadenamiento de la apoptosis, se planteó el estudio de la ...
OBJETIVOS
A la vista de la diversidad de factores y de las contraindicaciones encontrada en la bibliografía sobre la intervención de distintos factores en el desencadenamiento de la apoptosis, se planteó el estudio de la apoptosis en neutrófilos, centrado en tres aspectos, el papel del calcio, la participación de la PKC y la intervención de metabolitos reactivos del oxígeno, ya que el neutrófilo es una célula potencialmente apoptótica, con un potencial oxidativo grande y que se activa por mecanismos en los que están implicados el Ca2+ y la PKC.
- En relación al calcio, se planteó estudiar las variaciones en las concentraciones intracelulares de calcio en neutrófilos sometidos a diferentes estímulos, apoptóticos y no apoptóticos, con el fin de comprobar si en este tipo de célula las variaciones intracelulares de Ca2+ estaban relacionadas con el proceso de apoptosis. Particularmente estudiando el efecto de tapsigargina, potente activador de apoptosis y regulador de los flujos celulares de calcio.
- Respecto a la proteinkinasa C, se trató de estudiar el comportamiento de estas células en presencia de activadores e inhibidores de esta proteína, y observar si existía alguna relación entre la activación o inhibición de la PKC y el desencadenamiento de la apoptosis en los neutrófilos. Una vez que se estudió la participación de la PKC en el desencadenamiento de la apoptosis y su actuación en la regulación de los flujos de calcio, se planteó ver la posible regulación de estos hechos por la fosforilación de alguna proteína de membrana.
- Respecto a los metabolitos reactivos del oxígeno, parece aceptado mayoritariamente que son responsables de la activación del proceso de apoptosis. En estas células, el estudio de este supuesto era especialmente importante por ser precisamente los neutrófilos los responsables de la producción de los radicales libres, y verse sometidos de manera continua a altas concentraciones de los mismos. El planteamiento era estudiar si la activación en la producción de MRO suponía un incremento en la apoptosis en estas células, que por otro lado se sabía que sufren apoptosis espontánea. Suponiendo además que la inducción de la apoptosis del neutrófilo por MRO podría ser de alguna manera un mecanismo de defensa tisular, ya que evitaría las lesiones que los radicales libres pueden producir en los tejidos adyacentes a la zona donde tiene lugar la reacción de inflamación.
CONCLUSIONES
1. El neutrófilo control sin tratar, sufre un incremento paulatino en la concentración de calcio libre en el citoplasma. [Ca2+]i.
2. En los neutrófilos existe una relación directa entre el incremento de [Ca2+]i y el desencadenamiento de la apoptosis. El tratamiento de los neutrófilos con tapsigargina induce la entrada de calcio desde el espacio extracelular, simultáneamente se observa una aceleración de la muerte celular programada.
3. El incremento en la concentración de calcio relacionado con la apoptosis deber ser sostenido, ya que incrementos transitorios en la concentración de calcio no supone una activación de la apoptosis.
4. El éster de forbol PMA (forbol miristato acetato, agente promotor de tumores), tiene un efecto bloqueante de la entrada de calcio en neutrófilos. Bloquea tanto la entrada de calcio espontánea que ocurre en el neutrófilo, como la inducida por la tapsigargina. La incubación de los neutrófilos con tapsigargina y PMA da lugar a un incremento inicial de las concentraciones de calcio, que vuelve a sus valores basales a los pocos minutos. Esto pone de manifiesto que el PMA ejerce su acción sobre la entrada de calcio extracelular y no sobre la primera fase de deplección de los depósitos intracelulares.
5. El PMA ejerce una acción bloqueante de la apoptosis en neutrófilos, evitando tanto la apoptosis espontánea como la que se induce con agentes que incrementan la concentración de calcio. El tratamiento con inhibidores de PKC conduce a una activación de la apoptosis en los neutrófilos. Por tanto se puede afirmar que la activación de PKC conduce a una inhibición de la apoptosis en los neutrófilos.
6. En las células tratadas con PMA (tanto solo como con tapsigargina), se observa la fosforilación de unas proteínas de membranas de 50 y 65 kDa aproximadamente, que no se observan en las células tratadas con tapsigargina o en las células utilizadas como control.
7. La producción de metabolitos reactivos del oxígeno (MRO), no supone la activación de la muerte por apoptosis, ya que al estimular la NADPH oxidasa por PMA se incrementa notablemente la producción de estos metabolitos sin encontrar en ningún caso una activación de la muerte celular programada. Es más, el PMA bloquea la apoptosis aún siendo un potente activador de la NADPH oxidasa, lo que evidencia que no existe una relación entre los metabolitos reactivos del oxígeno y la apoptosis en el neutrófilo.
9. El tratamiento de las células con estaurosporina conduce a una disminución de la actividad de la NADPH oxidasa y sin embargo se observa una activación de la apoptosis. Esto confirma que no hay una participación de los metabolitos reactivos del oxígeno en el desencadenamiento de la apoptosis.
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