Papel del sistema ubiquitina proteasoma en la respuesta a terapias antimitóticas y su significado clínico en cáncer

Abstract

Taxanes are established in the treatment of metastatic breast cancer and early breast cancer as potent chemotherapy agents. However, their therapeutic usefulness s limited by de-novo refractoriness or acquired resistance. Despite all efforts, the mechanisms of resistance have not yet been fully understood. The aim of this thesis was to find new predictive markers of recurrence in breast cancer and new predictive markers of response to taxanes treatments We investigated the role of FBXW7 and their substrates MCL1 and PLK1 in regulating the apoptotic response to paclitaxel treatment in breast cancer cells and their expression in breast cancer tissues. FBXW7 is a component of SCF (complex of SKP1, CUL1 and F-box-protein)-type ubiquitin ligases that targets several oncoproteins for ubiquitination and degradation by the proteasome. FBXW7 regulates cellular apoptosis by targetingMCL1 for ubiquitination. Recently, we identified PLK1 as a new substrate of FBXW7 modulating the intra-S-phase DNA-damage checkpoint. Paclitaxel-sensitive MDA-MB- 468 and a paclitaxel-resistant MDA-MB-468R subclone were used to study the role of FBXW7 and substrates in paclitaxel-induced apoptosis. Our results showed that forced expression of FBXW7 or downregulation of MCL1 or PLK1 restored sensitivity to paclitaxel in MDA-MB-468R cells. By contrary, FBXW7-silenced MDA-MB-468 cells became resistant to paclitaxel. The expression of FBXW7 and substrates were studied in 296 invasive carcinomas by immunohistochemistry and disease-free survival was analyzed in a subset of patients treated with paclitaxel. In breast cancer tissues, loss of FBXW7 correlated with adverse prognosis markers and loss of FBXW7 and MCL1 or PLK1 accumulation were associated with diminished disease-free survival in paclitaxeltreated patients. According to our results FBXW7, MCL1 and PLK1 may be relevant predictive markers of tumor progression and response to paclitaxel treatment. Also we demonstrated that FBXW7 regulates the response to paclitaxel by targeting MCL1 and PLK1 in breast cancer cells and thus targeting these substrates may be a valuable adjunct for paclitaxel treatment. Herein, due the importance of MCL1 in mitotic cell death we used obatoclax in combination with paclitaxel as a mechanism of sensitization to antimitotic drugs in breast cancer MDA-MB-231 cells. We also highlight the importance of the order of the administration of both drugs and its effect on the response to these treatments. Our results showed that the administration of obatoclax enables to restore the sensitivity to paclitaxel in MDA-MB-231 cells. Finally, we analyzed the epithelial–mesenchymal transition (EMT) as a mechanism which is involved in the development of acquired resistance to paclitaxel in breast cancer. EMT is a a complex process by which epithelial cells transit to mesenchymal phenotype in order to adquire enhanced migratory capacity, invasiveness, increased resitance to apoptosis and production of extracellular matrix components. Herein, we studied the role of EDIL3, a αvβ3 integrin ligand, as a novel regulator of EMT which contributes to paclitaxel resistance in breast cancer cells. The analysis of the whole genome expression profiles of breast cancer cells allowed us to identify that EDIL3 and mesenquimal makers were hightly expressed in paclitaxel resistant MDA-MB-468R. Silencing EDIL3 gene discreased mesenchymal markers and restored sensitivity to paclitaxel in MDA-MB-231 cells. Disrupting the ligation of EDIL3 to integrins via RGD-blocking by cilengitide showed that EDIL3 is abundantly secreted by paclitaxel resistant MDA-MB-468R and MDA-MB-231. The administration of cilengitide in combination with paclitaxel resulted in the increased of sensitivity to paclitaxel in MDA-MB-231 breast cancer cells. Our findings demonstrated that EDIL3 may be contribute to the development of paclitaxel resistance and the administration of paclitaxel combinated with cilengitide as a new and effective therapeutic strategy for the treatment of breast cancer.

Los taxanos se utilizan en el tratamiento del cáncer de mama metastásico y en las etapas tempranas de la enfermedad como potentes agentes quimioterápicos. Sin embargo, su utilidad terapéutica está limitada debido al desarrollo de resistencias de novo o adquiridas. A pesar de todos los esfuerzos, los mecanismos de resistencia no se conocen completamente. El objetivo de esta tesis es encontrar nuevos marcadores predictivos de recurrencia en cáncer de mama y de respuesta al tratamiento con taxanos. Hemos investigado el papel de FBXW7 y de sus sustratos MCL1 y PLK1 en la regulación de la respuesta apoptótica en el tratamiento con paclitaxel en células tumorales de mama así como su expresión en carcinomas de mama. FBXW7 es un componente del complejo de ubiquitina ligasa SCF (SKP1, CUL1 y F-box) que se encarga de ubiquitinar a numerosas oncoproteínas para su degradación por el proteasoma. FBXW7 regula la apoptosis celular mediante la ubiquitinación de MCL1. Recientemente, hemos identificado que PLK1 es un nuevo sustrato de FBXW7 que modula el punto de control del daño al ADN en la fase S. Hemos utilizado las células sensibles a paclitaxel MDA-MB-468 y resistentes a paclitaxel MDA-MB-468R para estudiar el papel de FBXW7 y sus sustratos en la apoptosis inducida por paclitaxel. Nuestros resultados demuestran que la sobreexpresión de FBXW7 o el silenciamiento de MCL1 o PLK1 restablecen la sensibilidad a paclitaxel en las células MDA-MB- 468R. Por el contrario, las células MDA-MB-468 silenciadas para FBXW7 se convierten en resistentes a paclitaxel. Asimismo, estudiamos la expresión de FBXW7 y sus sustratos mediante inmunohistoquímica en 296 carcinomas invasivos y analizamos el tiempo libre de enfermedad en un subconjunto de pacientes tratados con paclitaxel. En los tejidos de cáncer de mama, la pérdida de FBXW7 correlacionó con marcadores de pronóstico adverso y la pérdida de FBXW7 y la acumulación de MCL1 o PLK1 se asoció con disminución del tiempo libre de enfermedad en los pacientes tratados con paclitaxel. De acuerdo con nuestros resultados, FBXW7, MCL1 y PLK1 podrían ser marcadores predictivos relevantes de la progresión tumoral y la respuesta al tratamiento con paclitaxel. Además demostramos que FBXW7 regula la respuesta a paclitaxel a través del control de MCL1 y PLK1 en células de cáncer de mama y por lo tanto estos sustratos podrían tener un valor añadido como dinas farmacológicas en el tratamiento con paclitaxel. En este sentido, dada la importancia de MCL1 en la muerte celular en mitosis hemos analizado el tratamiento de obatoclax en combinación con paclitaxel como mecanismo de sensibilización a fármacos antimitóticos en las células MDA-MB- 231. Además resaltamos la importancia del orden en la administración de ambos fármacos y su efecto en la respuesta al tratamiento. Nuestros resultados demuestran que la administración de obatoclax permite restablecer la sensibilidad al tratamiento con paclitaxel en las células MDA-MB-231. Finalmente, hemos analizado el fenómeno de transición epitelio-mesénquima (EMT) como un mecanismo involucrado en el desarrollo de la resistencia adquirida a paclitaxel en cáncer de mama. EMT es un proceso complejo en el que las células epiteliales cambian a un fenotipo mesenquimal para adquirir mayor capacidad migratoria, invasividad, incremento de la resistencia a apoptosis y producción de componentes de la matriz extracelular. En este contexto, hemos estudiado el papel de EDIL3, un ligando de integrina αvβ3, como un novedoso regulador de EMT que contribuye a la resistencia a paclitaxel en células tumorales de mama. El análisis de la expresión génica en células de cáncer de mama nos ha permitido identificar que EDIL3 y marcadores mesenquimales se encontraban sobreexpresados en las células resistentes a paclitaxel MDA-MB-468R. El silenciamiento de EDIL3 disminuyó la expresión de marcadores esenquimales y restableció la sensibilidad a paclitaxel en las células MDA-MB-231. La perturbación de la unión de EDIL3 a la integrina mediante el bloqueo del motivo de unión a integrina RGD a través de la administración de cilengitide mostró que EDIL3 se secretaba de manera más abundante en las células resistentes a paclitaxel. La administración de cilengitide en combinación con paclitaxel resultó en un incremento de la sensibilidad a paclitaxel en las células MDA-MB-231. Nuestros hallazgos demostraron que EDIL3 podría contribuir al desarrollo de resistencia a paclitaxel y que la administración de paclitaxel en combinación con cilengitide podría suponer una estrategia terapéutica efectiva en el tratamiento de cáncer de mama.