Regulación de la producción del Exopolisacárido en Sinorhizobium fredii HH103, un simbionte de la soja y otras leguminosas.

Abstract

Los rizobios son bacterias del suelo pertenecientes a las clases α- y β-Proteobacteria y que son capaces de llevar a cabo la fijación biológica del nitrógeno molecular en simbiosis con plantas leguminosas (Spaink et al., 1998; Suzaki et al., 2015) En esta relación, los rizobios inducen la formación de nuevos órganos llamados nódulos donde se diferencian a bacteroides, el estado capaz de fijar nitrógeno. Durante el proceso simbiótico tiene lugar un complejo diálogo molecular entre la planta y la bacteria, necesario para la infección de las raíces de la planta y la invasión de los nódulos formados por la planta. Los rizobios se encuadran en diferentes géneros de bacterias, siendo los más estudiados Rhizobium, Sinorhizobium (actualmente denominado Ensifer; Willems, 2006), Bradyrhizobium y Mesorhizobium, todos ellos pertenecientes a la clase α-Proteobacteria. Entre las leguminosas noduladas por los rizobios, se pueden encontrar varios e importantes plantas agrícolas como soja, judía y cowpea. La soja (Glycine max) es la leguminosa más importante agronómicamente a nivel mundial ya que se puede emplear para múltiples usos como alimento humano y animal, obtención de aceites vegetales a partir de sus semillas así como de productos “nutracéuticos” (beneficiosos para la salud) como isoflavonas, soponinas o fitoesteroles. La soja puede ser nodulada por estirpes de diferentes especies que pertenecen a los géneros Sinorhizobium, Mesorhizobium y Bradyrhizobium (Margaret et al., 2011; Rodríguez-Navarro et al., 2011), que a su vez pueden diferenciarse en función de su tasa de crecimiento (desde rizobios de crecimiento rápido a lento, respectivamente). S. fredii es una especie descubierta en China en 1985, y fue el primer rizobio de crecimiento rápido que incluía estirpes capaces de nodular soja. Las estirpes de S. fredii son capaces de nodular un alto número de leguminosas, pero muestran diferencias en su capacidad de nodular diferentes variedades de soja. De hecho, las tres estirpes más estudiadas hasta ahora difieren en esta característica: S. fredii NGR234 no es capaz de nodular soja, S. fredii USDA257 nódula variedades asiáticas de soja, pero es inefectivo con variedades americanas, y S. fredii HH103 es capaz de nódular ambos cultivares de soja, asiáticos y americanos. La simbiosis requiere un coordinado intercambio de señales entre la planta y el rizobio, y sólo cuando ambos simbiontes son compatibles, tiene lugar el proceso de nodulación (Downie, 2007; López-Baena et al., 2016). Este proceso comienza con la secreción, por parte de la planta, de un grupo de compuestos fenólicos llamados flavonoides que interaccionan con un regulador transcripcional bacteriano de tipo LysR, NodD. Sólo los flavonoides compatibles son capaces de activar este regulador. Por lo tanto, este paso establece una barrera de especificidad simbiótica para seleccionar sólo los simbiontes compatibles. Posteriormente, NodD activa la expresión de genes mediante su unión a secuencias específicas y conservadas de ADN localizas aguas arriba de estos genes y denominadas nod boxes (NB). Uno de los grupos de genes activados por NodD son aquellos (genes nod) responsables de la síntesis de los factores Nod (NF). Los NF son moléculas de lipo-quito-oligosacáridos compuestas de 2 a 6 residuos de N-acetil-glucosamina unida por enlaces β-1,4. El residuo de N-acetil-glucosamina localizado en el extremo no reductor se encuentra acilado por un ácido graso. Los NF pueden estar decorados con diferentes tipos de sustituciones (grupos fucosilos, metilos, sulfatos y acetilos) y ácidos grasos. Los NF se detectan por parte de la planta a través de los receptores de los NF (NFRs) localizados en las membranas de los pelos radicales. Este paso establece otra barrera simbiótica ya que el reconocimiento de los NF apropiados promueve la infección bacteriana y el inicio del desarrollo nodular. En caso positivo, el reconocimiento de los NF provoca una oscilación de la concentración de calcio dentro de los pelos radicales que, a través de una cascada de señalización, provoca diferentes respuestas, principalmente la curvatura del pelo radical (atrapando la población de rizobios) y formación de primordios nodulares. Posteriormente, la bacteria penetra dentro del pelo radical a través de unas estructuras tubulares llamados tubos de infección y eventualmente se liberan a células vegetales poliploides localizadas dentro de los nódulos. Dentro de estas células, las bacterias se diferencian en bacteroides y llevan a cabo la fijación de nitrógeno. Además de la infección a través de pelos radicales, existe otro método de infección llamado crack entry, donde la bacteria entra en las raíces a través de heridas en la superficie radical. Además de los NF, hay otras señales bacterianas que juegan papeles clave en la interacción simbiótica (Downie, 2010; López-Baena et al., 2016). Estas señales incluyen proteínas efectoras (llamadas Nops, nodulation outer protein), que se liberan al interior de las células hospedadoras a través del sistema de secreción de tipo III, y polisacáridos superficiales. En cuanto a los polisacáridos superficiales, los principales involucrados en simbiosis son los lipopolisacáridos (LPS) y los polisacáridos capsulares (KPS), los cuales se anclan a la membrana externa, los glucanos cíclicos (GC), localizados en el espacio periplásmico, y lo exopolisacáridos (EPS), que se liberan al medio extracelular o están débilmente unido a la superficie bacteriana. Se piensa que las Nops y los polisacáridos superficiales tienen papeles importantes en la interacción simbiótica como la disminución de la respuesta defensiva de la planta y/o actuando como señal simbiótica que se requiere a lo largo de las diferentes etapas del proceso de nodulación. Nuestro grupo de investigación ha trabajado en el estudio de la interacción simbiótica de S. fredii HH103 con diferentes plantas hospedadoras, incluyendo soja, desde hace más de 30 años (Margaret et al., 2011; López-Baena et al., 2016). Recientemente, hemos secuenciado el genoma de HH103 (Vinardell et al., 2015), compuesto por el cromosoma (4,3 Mb) y seis plásmidos, los cuales se nombran con una letra en función del tamaño del plásmido, pSfhh103a1 (~24 Kb), pSfhh103a2 (~25 Kb), pSfhh103b (~62 Kb), pSfhh103c (~144 Kb), pSfhh103d (~589 Kb) y pSfhh103e (~2,1 Mb). Durante los últimos 15 años, nuestro grupo ha estudiado los diferentes polisacáridos superficiales centrándose en sus estructuras, su relevancia simbiótica con diferentes plantas hospedadoras y la regulación de su producción. El principal objetivo de esta tesis era profundizar en la investigación de algunos aspectos específicos de los polisacáridos superficiales de S. fredii HH103. Específicamente, los objetivos concretos de esta tesis eran: 1. Caracterizar la región genética rkp-2 de S. fredii HH103 y estudiar su implicación en la producción de diferentes polisacáridos superficiales. 2. Estudiar la relevancia de los diferentes polisacáridos superficiales de S. fredii HH103 en su interacción simbiótica con la leguminosa modelo Lotus. 3. Estudiar la regulación de la producción de EPS mediada por flavonoides en S. fredii HH103. 4. Caracterizar los genes mucR1 y mucR2 de S. fredii HH103 y estudiar su papel regulador sobre los genes involucrados en la producción de EPS. Objetivo 1. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en Plant and Soil (Acosta-Jurado et al., 2017. Plant and Soil. Doi:10.1007/s11104-017-3268-z). En S. meliloti Rm41, los genes relacionados con la producción de KPS se distribuyen entre tres regiones genéticas (López-Baena et al., 2016), rkp-1, involucrada en la síntesis del lípido transportador del KPS, rkp-3, implicada en el transporte y síntesis de la subunidad de repetición del KPS, y rkp-2, compuesto por dos genes cuyos productos son responsables de la producción de ácido UDP-galacturónico desde el ácido UDP-glucurónico, catalizado por LpsL, y ácido UDP-glucurónico desde UDP-glucosa, catalizado por RkpK. Ambos genes se requieren para la producción de LPS, y rkpK también es necesario para la biosíntesis de KPS debido a la presencia de ácido glucurónico en este polisacárido. Estas tres regiones también están presentes en S. fredii HH103. En trabajos anteriores, nuestro grupo de investigación ha llevado a cabo los estudios de las regiones rkp-2 y rkp-2 y ha demostrado su implicación en la producción de KPS, así como la de la región rkp-3 en la síntesis de LPS. En esta tesis, hemos investigado la implicación de la región rkp-2 en la producción de los polisacáridos superficiales de HH103. En este trabajo, hemos demostrado que los genes lpsL y rkpK de S. fredii HH103 no forman una unidad transcripcional y que la tasa de transcripción de rkpK es mucho mayor que la de lpsL. Los experimentos de PAGE mostraron que la inactivación de cada uno de estos genes dio lugar a alteraciones en el LPS, pero no afectó a la producción de KPS (confirmado por H-NMR), lo cual está en consonancia con la ausencia de ácidos urónicos en este polisacárido en S. fredii HH103. La mutación de rkpK también tuvo impacto sobre la producción del exopolisacárido (EPS), probablemente por la presencia de ácido glucurónico en este polisacárido. El aspecto sobre placas de YMA, cuantificación de los equivalentes de glucosa en medio YM y los experimentos de H-RMN confirmaron que la inactivación de rkpK no provoca una alteración del EPS sino una incapacidad para producir este polisacárido, sugiriendo que la disponibilidad de ácido glucurónico es esencial para la biosíntesis de EPS. El mutante rkpK mostró un incremento en la auto-agregación y osmosensibilidad y una reducción de la formación del biofilm sobre superficies plásticas. La inactivación de rkpK afectó negativamente a la simbiosis con cowpea (una reducción de alrededor del 50% del número de nódulos fijadores de nitrógeno) pero no con soja. La mutación de lpsL condujo a una deficiencia completa con cowpea, mientras que las plantas de soja inoculadas con este mutante sólo formaron pseudonódulos. En ambas plantas, el mutante lpsL mostró defectos en la infección de sus raíces. Los resultados presentados en este capítulo están son un buen ejemplo de como en dos bacterias íntimamente relacionadas (como S. meliloti y S. fredii) el mismo gen puede estar involucrado en la producción de diferentes polisacáridos superficiales, así que la inactivación de ese gen puede tener un impacto diferente en la capacidad simbiótica de estas bacterias con sus plantas hospedadoras. Además, nuestros resultados están en consonancia con trabajos anteriores de nuestro grupo demostrando la alta relevancia del LPS de HH103 en simbiosis con diferentes plantas hospedadoras. Objetivo 2. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en Molecular Plant-Microbe Interactions (Acosta-Jurado et al., 2016a. Mol Plant Microbe Interact. 29:925-937). En trabajos anteriores de nuestro grupo de investigación se ha demostrado que S. fredii HH103 induce nódulos fijadores de nitrógeno en Lotus burttii pero nódulos inefectivos en L. japonicus Gifu (Sandal et al., 2012). En nuestro laboratorio tenemos disponible una colección de mutantes de HH103 afectados en la producción de diferentes polisacáridos superficiales. En esta tesis, hemos usado esta colección para investigar el posible papel (positivo o negativo) de cada uno de los polisacáridos superficiales de HH103 en su interacción con L. burttii y L. japonicus Gifu. Además, los estudios de microscopia confocal demostraron que S. fredii HH103 penetra en las raíces de L. burttii a través de roturas epidérmicas (de manera dependiente de factores Nod), a diferencia de Mesorhizobium loti MAFF303099 que infecta esta planta mediante tubos de infección (Maekawa et al., 2009). En cuanto a la interacción con L burttii, los mutantes de S. fredii HH103 incapaces de producir KPS y/o EPS no mostraron ningún tipo de defecto simbiótico, a diferencia de aquellos que tienen un perfil de LPS alterado, los cuales estuvieron afectados negativamente (se dieron reducciones severas del número de nódulos fijadores de nitrógeno). El mutante de S. fredii HH103 del gen cgs, incapaz de producir GC, mostró el mismo fenotipo simbiótico que con otras plantas hospedadoras (Crespo-Rivas et al., 2009); totalmente deficiente. Por otro lado, ninguno de los mutantes de S. fredii HH103 en polisacáridos superficiales ganó una nodulación efectiva con L. japonicus Gifu, sugiriendo que ninguno de estos polisacáridos es el responsable de la incompatibilidad simbiótica de S. fredii HH103 con esta planta. Objetivo 3. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en PLOS ONE (Acosta-Jurado et al., 2016b. PLOS ONE. 11:e0160499). A pesar del hecho que el EPS no muestra un papel importante en la simbiosis de S. fredii HH103 con diferentes leguminosas hospedadoras como soja, cowpea, Glycyrrhiza uralensis y Lotus burttii (Parada et al., 2006; Hidalgo et al., 2010; Margaret-Oliver et al., 2012; Acosta-Jurado et al., 2016a), la producción de este polisacárido está altamente regulado. Anteriores trabajos de nuestro grupo demostraron que la presencia de genisteína, un flavonoide inductor de los genes nod (Vinardell et al., 2004a), provocó una disminución de la mucosidad de HH103 en placas de YMA (Vinardell et al., 2004b). En esta tesis se demuestra que esta disminución de la mucosidad se debe a una reducción de la producción de exopolisacárido (confirmado por cuantificación de equivalentes de glucosa y análisis de H-RMN), y que este fenómeno no se da en otras estirpes de S. fredii como USDA257 o NGR234. Esta regulación negativa de la producción de EPS depende tanto de la capacidad del flavonoide para inducir la expresión de los genes nod como de la presencia de NodD1, indicando que, en S. fredii HH103, la biosíntesis de este polisacárido está conectada con el regulón nod. De hecho, en estudios anteriores hemos demostrado que NolR, un represor de los genes nod, tiene un efecto positivo sobre la producción de EPS en HH103. Teniendo en cuenta la importancia del EPS para los biofilm bacterianos, esta reducción de la producción de EPS por el tratamiento con flavonoides se correlaciona con la reducción de la capacidad formadora de biofilm. Mediante el uso de análisis de RT-PCR cuantitativa hemos demostrado que la expresión de los genes exoY1 y exoK se reprimió en cultivos de fase estacionaria de S. fredii HH103 en presencia de genisteína, siendo esta represión mayor en ausencia de NolR. Así, los resultados presentados en este trabajo demostraron que en la producción de EPS en S. fredii HH103 se regula de forma opuesta a otras señales bacterianas como los factores Nod y los efectores del sistema de secreción de tipo 3: Se reprime por flavonoides y NodD1 y se potencia por NolR. Estos resultados son acordes con nuestras observaciones anteriores en las que la ausencia de la producción de EPS en S. fredii HH103 no sólo no va en detrimento, sino que es beneficiosa para la simbiosis con soja. Además, nuestros resultados mostraron como bacterias íntimamente relacionadas pueden diferir en la regulación de sus polisacáridos superficiales: en S. fredii NGR234 la presencia de flavonoides disminuye la cantidad de KPS producido y promueve la biosíntesis de un tipo nuevo de LPS mientras que en HH103 afecta negativamente a la producción de EPS. Objetivo 4. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en Molecular Plant-Microbe Interactions (Acosta-Jurado et al., 2016c. Mol Plant Microbe Interact. 29:700-712). En los rizobios, el control de la producción de EPS es muy complejo y conlleva la participación de numerosas proteínas reguladoras, segundos mensajeros como di-GMP-c y sistemas de quorum sensing. Dentro de los reguladores, la proteína de tipo zinc finger MucR potencia la producción de EPS en los rizobios, como Sinorhizobium meliloti y Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, y participa en diversos procesos en otras bacterias como Caulobacter, Pseudomonas o Brucella (Janczarek, 2011; Mirabella et al., 2013; Caswell et al., 2013; Wang et al., 2015). MucR regula la expresión génica mediante su unión a secuencias palindrómicas llamadas mucR boxes. Estudios recientes han demostrado que esta proteína puede considerarse como un regulador global ya que está involucrado en el control de la expresión de genes de movilidad, quimiotaxis, virulencia e incluso NF, dependiendo de la bacteria. La secuenciación reciente del genoma de S. fredii HH103 ha revelado la presencia de dos copias de mucR en esta estirpe, mucR1 y mucR2. En esta tesis, hemos estudiado estos genes, centrándonos en su relevancia en la producción de EPS y en la simbiosis con soja y L. burttii. Como ha sido recientemente descrito en mucR2 de CCBAU45436 (Jiao et al., 2016), probablemente MucR2 de S. fredii HH103 no sea funcional debido a un cambio de pauta de lectura en su gen codificante. De hecho, el mutante mucR2 de S. fredii HH103 no mostró ninguna diferencia con la estirpe silvestre en ninguna de las características analizadas en este trabajo. Por el contrario, la inactivación de mucR1 provoca una reducción drástica de la producción de EPS, confirmado por aspecto de la mucosidad en placas de YMA, experimentos de H-NMR y cuantificación de los equivalentes de glucosa. Inesperadamente, el mutante ΔmucR1 mostró un incremento notable en su capacidad formadora de biofilm, probablemente debido al incremento de la agregación en la interfase aire-líquido. Además, la producción de GC extracelulares se incrementó en este mutante, probablemente como consecuencia de la reducción en la producción de EPS. Este mutante también mostró una reducción drástica de la capacidad fijadora de nitrógeno con G. max y L. burttii. Sin embargo, en estas dos leguminosas, el número de nódulos inducidos por el mutante mucR1 se incrementó y redujo respectivamente en comparación con la estirpe parental, indicando que MucR1 pueda afectar de forma diferente a la nodulación dependiendo de la planta hospedadora. Los análisis de RNA-Seq llevados a cabo en presencia y ausencia de flavonoides demostraron que MucR1 controla la expresión de cientos de genes (incluyendo algunos relacionados con la movilidad, producción de EPS o transporte de GC), algunos de ellos relacionados con el regulón nod. Estos estudios confirmaron trabajos anteriores indicando que en los rizobios MucR es un regulador global que controla numerosos procesos que pueden ser importantes en la transición de vida libre al estado simbiótico.

Rhizobia are soil α- and β-proteobacteria able to stablish a nitrogen-fixing symbiosis with legume plants (Spaink et al., 1998; Suzaki et al., 2015). In this relationship, rhizobia induce the formation of new organs called nodules where they differentiated to bacteroids, the bacterial form able to fix nitrogen. The symbiotic process requires a complex molecular dialogue between plant and bacteria resulting in root infection the invasion of the nodules formed by the plant. There are different bacterial genera than can be included in the rhizobia group, being the most studied Rhizobium, Sinorhizobium (currently Ensifer; Willems, 2006), Bradyrhizobium and Mesorhizobium, all of them belonging to α-Proteobacteria. Among the legumes nodulated by rhizobia, there are several highly important crop plants like soybean, bean and cowpea. Soybean (Glycine max) is the most important worldwide agronomic legume since it can be used for multiple targets, such as for human and animal feeding, to get vegetal oil from its seeds and nutraceutical molecules like isoflavones, saponines or phytosterols, which are beneficial to human health. Soybean can be successful nodulated by strains belonging to different species of the Sinorhizobium, Mesorhizobium and Bradyrhizobium genera (Margaret et al., 2011; Rodríguez-Navarro et al., 2011), which can be differentiated according to their growth rate (from fast growing bacteria to slow growing bacteria, respectively). S. fredii is a species discovered in China, in 1985, and was the first fast growing bacteria that includes strains able to nodulate soybean. S. fredii strains are able to nodulate a very high number of host legumes but show differences in their ability to nodulate different soybean varieties. In fact, the three strains more studied so far differ in this ability: S. fredii NGR234 is not able to nodulate soybean, S. fredii USDA257 nodulates Asiatic soybeans but it is ineffective with American varieties, and S. fredii HH103 is able to nodulate both, American and Asiatic, soybean cultivars. The symbiosis requires a coordinated signal exchange between plants and rhizobia, and only when both symbionts are compatible, the nodulation process takes place (Downie, 2007; López-Baena et al., 2016).This process starts with the secretion by legume roots of a group of phenolic compounds called flavonoids that interact with a bacterial LysR transcriptional regulator, NodD. Only compatible flavonoids will activate the bacterial NodD protein. Therefore, this step stablishes a symbiotic specificity barrier to select compatible symbionts. In turn, NodD activates bacterial nodulation gene expression by binding to specific and conserved DNA sequence, named nod boxes (NB), located upstream of these genes. One of the groups of genes activated by NodD are those one (nod genes) responsible for Nod factors (NF) synthesis. NF are lipochitooligosaccharide molecules composed of 2 to 6 residues of N-Acetyl-Glucosamine residues linked by β-1,4 glycosidic bonds. The N-Acetyl-glucosamine residue locate on the non-reducing end is acylated with a fatty acid. NF can be decorated of different manners with different substitutions (fucosyl, methyl, sulphate and acetyl groups) and types of fatty acids. NF are perceived by the plant through Nod Factor membrane receptors (NFRs) located in the root hair membranes. This step entails another symbiotic barrier since only the recognition of appropriate NF will elicit bacterial infection and the initiation of nodule development. In a positive case, NF recognition will cause a specific calcium spiking inside root hairs that, through a signalling cascade will provoke different responses, mainly root hair curling (trapping a rhizobial population) and nodule primordia formation. Bacteria will penetrate inside the root hairs through tubular structures called infection threads and eventually will be delivered into polyploid plant cells located inside nodules. Inside those cells, bacteria will differentiate into bacteroids and fix nitrogen. Besides of root hair infection, there is another infection way named crack entry, in which the bacteria enter into the root through injuries of the root surface (Downie, 2010; López-Baena et al., 2016). In addition to NF, there are other bacterial signals that play key roles in the symbiotic interaction. These signals include effectors proteins (called Nops, for nodulation outer proteins) delivered into host cells through a type III secretion system, and surface polysaccharides. Regarding surface polysaccharides, the main ones involved in symbiosis are Lipopolysaccharides (LPS) and capsular polysaccharides (KPS), which are anchored into the external membrane, the cyclic glucans (CG), located in the periplasmic space, and exopolysaccharides (EPS), that are released to the cell milieu or are weakly bound to their surface. Nops and surface polysaccharide are thought to have important roles in the interaction such as diminishing plant defence responses and/or acting as symbiotic signals required along different steps of the nodulation process. Our research group has been working in the study of the symbiotic interaction of S. fredii HH103 with different host plants, including soybean, for more than 30 years (Margaret et al. 2011; López-Baena et al., 2016). Recently, our group has sequenced the HH103 genome (Vinardell et al., 2015) revealing that it is composed by the chromosome (4.3 Mb) and six plasmids, which are named with a letter depending on the plasmid size, pSfhh103a1 (~24 Kb), pSfhh103a2 (~25 Kb), pSfhh103b (~62 Kb), pSfhh103c (~144 Kb), pSfhh103d (~589 Kb) y pSfhh103e (~2.1 Mb). During the last 15 years, our group has studied different HH103 surfaces polysaccharides focusing in their structures, their symbiotic relevance with different host legumes and the regulation of their production. The main objective of this thesis was to further research some specific aspects of S. fredii HH103 surface polysaccharides. More specifically, the concrete objectives of this work were: 1. To characterize the S. fredii HH103 rkp-2 genetic region and to study its involvement in the production of different surface polysaccharides. 2. To study the relevance of different S. fredii HH103 surface polysaccharides in its symbiotic interaction with the model legume Lotus. 3. To study the flavonoid-mediated regulation of exopolysaccharide (EPS) production by S. fredii HH103. 4. To characterize the S. fredii HH103 mucR1 and mucR2 genes and to study their putative regulatory role on genes involved in EPS production. Objective 1. The results presented in the corresponding chapter has already been published in Plant and Soil (Acosta-Jurado et al., 2017. Plant and Soil. doi:10.1007/s11104-017-3268-z). In S. meliloti Rm41, genes related to KPS production are distributed among three genetic regions (López-Baena et al., 2016), rkp-1, involved in the synthesis of the KPS lipid carrier, rkp-3, involved in KPS export and in the synthesis of the KPS repetition subunit, and rkp-2, composed by two genes whose encoded products are involved in the production of UDP-galacturonic acid from UDP-glucuronic acid, catalysed by LpsL, and UDP-glucuronic acid from UDP-glucose, catalysed by RkpK. Both genes are required for LPS production, and rkpK is also needed for KPS biosynthesis due to the presence of glucuronic acid in this polysaccharide. These three rkp regions are also present in S. fredii HH103. In previous works, our research group had already studied the rpk-1 and rkp-3 regions and demonstrated its involvement in KPS production as well as that of rkp-3 in LPS synthesis. In this thesis, we have investigated the involvement of the rkp-2 region in HH103 surface polysaccharides production. In this work, we showed that in S. fredii HH103 lpsL and rkpK do not form a transcriptional unit and that the transcriptional rate of rkpK is much higher than that of lpsL. PAGE experiments showed that inactivation of each of these genes resulted in alterations in LPS, but did not affect KPS production (confirmed by H-NMR), which agrees with the lack of uronic acids in S. fredii HH103 KPS. Mutation of rkpK also had an impact on HH103 exopolysaccharide (EPS) production, most probably due to the presence of glucuronic acid in this polysaccharide. Mucoidy scoring on YMA plates, quantification of glucose equivalents on YM medium and H-NMR experiments confirmed that rkpK inactivation not resulted in an altered EPS but in the unability to produce this polysaccharide, suggesting that the availability of glucuronic acid is essential for EPS biosynthesis. The rkpK mutant exhibited increased bacterial autoaggregation and osmosensitivity and decreased biofilm formation on plastic surfaces. Inactivation of rkpK affected negatively symbiosis with cowpea (about 50% reduction on the number of nitrogen-fixing nodules) but not with soybean. Mutation of lpsL led to a complete symbiotic impairment with cowpea, whereas soybean plants inoculated with this mutant only formed pseudonodules. In both plants, the lpsL mutant showed defects in root infection. The results presented in this chapter are a good example of that in very close-related bacteria (such as S. meliloti and S. fredii) the same gene can be involved in the production of different surface polysaccharides, so inactivation of that gene may have a very different impact in the symbiotic abilities of these bacteria with their host plants. In addition, our results are in agreement with previous works of our group showing the high relevance of HH103 LPS in its symbiosis with different host legumes. Objective 2. The results presented in the corresponding chapter has already been published in Molecular Plant-Microbe Interactions (Acosta-Jurado et al., 2016a. Mol Plant Microbe Interact. 29:925-937). Previous works of our group had shown that S. fredii HH103 induces nitrogen-fixing nodules in Lotus burttii but ineffective nodules in L. japonicus Gifu (Sandal et al., 2012). In our laboratory there is available a collection of HH103 mutants affected in the production of different surface polysaccharides. In this thesis, we have used this collection in order to investigate the putative role (positive or negative) of each HH103 surface polysaccharide in its interaction with L. burttii and L. japonicus Gifu. In addition, confocal microscopy studies showed that S. fredii HH103 penetrates L. burttii roots through epidermal cracks (in a Nod-factor-dependent manner), in contrast to Mesorhizobium loti MAFF303099 that infect this plant through infection threads (Maekawa et al., 2009). Regarding interaction with L. burttii, S. fredii HH103 mutants unable to produce KPS and/or EPS did not show any kind of symbiotic defect, in contrast to those HH103 derivatives having an altered LPS, which were negatively affected (strong reductions of the number of nitrogen-fixing nodules formed). A S. fredii HH103 cgs derivative, unable to produce GC, showed the same symbiotic phenotype as with other host plants (Crespo-Rivas et al., 2009); full impairment. On the other hand, none of the S. fredii HH103 surface-polysaccharide mutants gained effective nodulation with L. japonicus Gifu, suggesting that none of these polysaccharides is responsible for this symbiotic incompatibility. Objective 3. The results presented in the corresponding chapter has already been published in PLOS ONE (Acosta-Jurado et al., 2016b. PLOS ONE. 11:e0160499). Despite the fact that EPS does not show an important role in S. fredii HH103 symbiosis with different host legumes such as soybean, cowpea, Glycyrrhiza uralensis and Lotus burttii (Parada et al., 2006; Hidalgo et al., 2010; Margaret-Oliver et al., 2012; AcostaJurado et al., 2016a), the production of this polysaccharide is highly regulated. Previous works of our group showed that the presence of genistein, an effective nod gene inducer flavonoid (Vinardell et al., 2004a), caused a decrease of HH103 mucoidy on YMA plates (Vinardell et al., 2004b). In this thesis, we showed that this diminution ofucoidy was due to a reduction of the production of exopolysaccharide (confirmed by quantification of glucose equivalents and by H-NMR analyses), and that this phenomenon did not take place other in S. fredii strains such as USDA257 or NGR234. This negative regulation of EPS production depended both on the ability of the flavonoid to induce nod gene expression and on the presence of NodD1, indicating that, in S. fredii HH103, the biosynthesis of this polysaccharide is connected with the nod regulon. In fact, in previous works we have shown that the nod gene repressor NolR has a positive influence on EPS production in HH103. In agreement with the importance of EPS for bacterial biofilms, this reduced EPS production upon treatment with flavonoids correlated with decreased biofilm formation ability. By using quantitative RT-PCR analysis we showed that expression of the exoY2 and exoK genes was repressed in late stationary cultures of S. fredii HH103 upon treatment with genistein, being this repression higher in the absence of NolR. Thus, results presented in this work demonstrated that in S. fredii HH103 EPS production is regulated just in the opposite way than other bacterial signals such as Nod factors and type 3 secreted effectors: it is repressed by flavonoids and NodD1 and enhanced by the nod repressor NolR. These results are in agreement with our previous observations showing that lack of EPS production by S. fredii HH103 is not only nondetrimental but even beneficial for symbiosis with soybean. In addition, our results showed how highly close-related bacteria differ in the regulation of their surface polysaccharides: in S. fredii NGR234 the presence of flavonoids diminishes the amount of KPS produced and elicits the biosynthesis of a novel type of LPS (Simsek et al., 2009; Ardissone et al., 2011) whereas in HH103 negatively affects EPS production. Objective 4. The results presented in the corresponding chapter has already been published in Molecular Plant-Microbe Interactions (Acosta-Jurado et al., 2016c. Mol Plant Microbe Interact. 29:700-712). In rhizobia, control of EPS production is highly complex and involves the participation of numerous regulatory proteins, second messengers like c-di-GMP and quorum-sensing systems. Within regulators, the zinc finger protein MucR enhances EPS production in rhizobia, like Sinorhizobium meliloti and Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, as well as participates in diverse processes in other proteobacteria like Caulobacter, Pseudomonas or Brucella (Janczarek, 2011; Mirabella et al., 2013; Caswell et al., 2013; Wang et al., 2015). MucR regulates gene expression by binding to palindromic sequences called mucR boxes. Recent studies have emonstrated that this protein can be considered as a global regulator since is involved in the control of motility, chemotaxis, virulence and even in NF gene expression, depending on the bacterium. The recent sequencing of the S. fredii HH103 genome revealed the presence of two copies of mucR in this strain, mucR1 and mucR2. In this thesis, we have studied these genes, focusing on their relevance in EPS production and in symbiosis with soybean and L. burttii. As it has been recently described of mucR2 of S. fredii CCBAU45436 (Jiao et al., 2016), most probably HH103 MucR2 is not functional due to a frame mutation in its encoding gene. In fact, the HH103 mucR2 derivative did not exhibit differences with the wild-type strain in any of the bacterial traits analysed in this work. In contrast, inactivation of mucR1 caused a dramatic reduction of EPS production, confirmed by scoring of mucoidy on YMA plates, H-NMR experiments and glucose equivalents quantification. Unexpectedly, HH103 ΔmucR1 exhibited a notable increase in its biofilm formation ability, most probably due to increased aggregation in the interphase liquid-air. In addition, extracellular CG production was highly increased in this mutant, most probably as a consequence of the reduction in EPS production. This mutant also showed a drastic reduction in nitrogenfixation capacity with G. max and L. burttii. However, in these two legumes, the number of nodules induced by the mucR1 mutant was significantly increased and decreased respectively with respect to the wild-type strain, indicating that MucR1 can differently affect nodulation depending on the host plant. RNA-Seq analysis carried out in the absence and presence of flavonoids showed that MucR1 controls the expression of hundreds of genes (including some related to motility, EPS production or CG transport), some of them being related to the nod regulon. These studies confirmed previous works indicating that in rhizobia MucR is a global regulator that controls numerous processes that can be important in the transition from a free-living to a symbiotic state.