Papel de la cromatina en la formación de R-loops

Abstract

La inestabilidad genómica es una patología celular asociada a múltiples enfermedades genéticas, incluido el cáncer (Aguilera & García-Muse, 2013). Fallos en procesos metabólicos que ocurren en el ADN, tales como la replicación o la reparación de daños, son una fuente de inestabilidad. Otra fuente importante de inestabilidad es la transcripción, ya sea porque impida la progresión de la maquinaria de replicación o porque genere estructuras nocivas como los bucles R (R-loops) (Santos-Pereira & Aguilera, 2015). Éstos están constituidos por un híbrido de ARN-ADN y la cadena sencilla de ADN desplazada, y se forman generalmente durante la transcripción por hibridación de la cadena de ARN naciente con la cadena molde de ADN. Aunque estas estructuras son intermediarios naturales de diversos procesos biológicos, su acumulación puede ser una fuente importante de inestabilidad genómica (Santos-Pereira & Aguilera, 2015). La relevancia biológica de los fenotipos de inestabilidad genética que presentan las células que acumulan R-loops nos hace plantearnos en esta tesis el estudio de los mecanismos o elementos celulares que están implicados en la formación de dichas estructuras. El ADN no está desnudo dentro de las células sino asociado a histonas y otras proteínas estructurales, formando la cromatina. La cromatina puede constituir una barrera para los procesos que ocurren en el ADN, por ello la célula ha desarrollado distintos mecanismos para solventar estas situaciones. Las modificaciones postraduccionales de las histonas favorecen el reclutamiento de remodeladores de la cromatina y chaperonas de histonas, facilitando el acceso al ADN (Tessarz & Kouzarides, 2014). Por lo tanto, cabe la posibilidad de que la cromatina sea un factor regulador de la formación de R-loops, controlando la accesibilidad del ARN al ADN. El objetivo principal de este trabajo es dilucidar si la cromatina tiene algún papel en la formación de R-loops y la inestabilidad genómica asociada, y si así fuera, explorarlo. En esta tesis hemos escrutado una colección de mutantes puntuales no esenciales de las histonas H3 y H4 en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae, para identificar mutaciones que alteran la formación de R-loops. Hemos identificado mutantes de ambas histonas que aumentan la inestabilidad de forma dependiente de AID y sensible a RNasa H, siendo el AID una enzima que actúa en la cadena sencilla desplazada del R-loop deaminando las citosinas y cuya acción incrementa la recombinación en levaduras con altos niveles de R-loops (Gómez-González & Aguilera, 2007). El análisis genético y molecular de estos mutantes confirma la acumulación de R-loops en los mismos, poniendo de manifiesto que la estructura de la cromatina ejerce un papel en prevención de la formación de híbridos de ARN-ADN. Los mutantes identificados no presentan defectos ni en replicación ni en transcripción, a diferencia de otros mutantes que acumulan R-loops, tales como hpr1Δ, rnh1Δ, sen1-1, etc (Huertas & Aguilera, 2003; Mischo et al., 2011). Por lo tanto, en esta tesis se describe por primera vez que los R-loops por sí mismos no suponen una amenaza para la integridad del genoma, ya que los mutantes de histonas identificados acumulan R-loops y no presentan fenotipos de inestabilidad. A nivel molecular observamos que los mutantes de histonas no acumulan histona H3 fosforilada en la serina 10 de la histona H3, una marca de cromatina condensanda, al contrario de los mutantes que acumulan R-loops y presentan inestabilidad genómica, tales como hpr1Δ o sen1-1 (Castellano-Pozo et al., 2013; Mischo et al., 2011). De hecho, los altos niveles de histona H3 fosforilada en la serina 10 y los fenotipos de inestabilidad presentes en los mutantes hpr1Δ o sen1-1 son suprimidos por las mutaciones de histonas seleccionadas, que impiden dicho incremento en fosforilación. Los datos sugieren que esta modificación postraduccional es necesaria para que el R-loop sea una fuente de roturas del ADN y, por tanto, de inestabilidad. En conclusión, los resultados obtenidos en esta tesis nos llevan a proponer que para que los R-loops causen inestabilidad genómica se requiere un paso adicional en el que el R-loop induciría cambios en la cromatina, tales como la fosforilación de la serina 10 de la histona H3. Esta tesis, por tanto, sugiere una explicación para la diferencia entre los R-loops que se consideran “buenos” y “malos”, y abre nuevas vías de investigación para comprender el papel de los R-loops y las modificaciones de la cromatina en el origen de la inestabilidad genómica.