Síntesis de iminoazúcares sp2 y evaluación de su actividad como chaperonas farmacológicas para el tratamiento de las enfermedades de Gaucher, Fabry y gangliosidosis GM1

Abstract

Las enfermedades de depósito lisosomal (Lysosomal Storage Disorders, LSDs), entre las que se encuentran la enfermedad de Gaucher (GD), la enfermedad de Fabry (FD) y la gangliosidosis GM1 (GM1) son un conjunto de enfermedades de carácter genético que afectan a un bajo porcentaje de la población mundial. Para la mayoría de ellas no se dispone aún de tratamiento eficaz. Se caracterizan por la disfunción de alguna de las enzimas encargadas de degradar glicoesfingolípidos en el interior del lisosoma. En muchos de los casos, la mutación genética en el origen de la enfermedad conlleva una modificación en la secuencia de aminoácidos de la proteína afectada que altera el plegamiento correcto de la misma. Las enzimas defectuosas son derivadas durante su biosíntesis hacia el proteosoma por el mecanismo de control de calidad del retículo endoplasmático y degradadas, no alcanzando por tanto su destino. Esto conduce a la acumulación del correspondiente sustrato en el lisosoma lo que, a su vez, da lugar a una variedad de patologías en general de carácter muy grave. Aunque en algunos casos la administración de la correspondiente enzima recombinante ha permitido mejorar enormemente la calidad de vida de los pacientes afectados, esta aproximación terapéutica no es hoy por hoy aplicable cuando existen implicaciones en el sistema nervioso central. El diseño de moléculas capaces de forzar el plegamiento correcto, rescatar la enzima mutante y promover su tráfico al lisosoma representa una alternativa para estos casos y ha dado lugar a la estrategia conocida como terapia de la chaperona farmacológica. Esta Tesis supone una contribución al desarrollo de chaperonas farmacológicas para GD, FD y GM1 basadas en glicomiméticos con estructura de iminoazúcares sp2. Compuestos de esta familia han demostrado comportarse como inhibidores potentes y selectivos de glicosidasas, incluyendo varias glicosidasas lisosomales humanas. A concentraciones subinhibitorias, son capaces de unirse a la enzima mutada en el retículo endoplásmico y acompañarla en su camino primero al aparato de Golgi para su maduración y luego al lisosoma, donde el exceso de sustrato los desplaza y el procesado tiene lugar. Datos de difracción de rayos X de los correspondientes complejos iminoazúcar sp2-enzima y estudios de relaciones estructura-actividad han permitido seleccionar buenos candidatos como chaperonas farmacológicas que han sido evaluados en fibroblastos de pacientes, en células COS que expresan mutaciones relacionadas con LSDs e incluso in vivo en ratones transgénicos. Un primer conjunto de los resultados obtenidos se refiere a la síntesis de dos nuevas familias de iminoazúcares sp2 derivados de 1-desoxinojirimicina (DNJ) y de su análogo de configuración L-ido (L-DIJ) capaces de actuar sobre las enzimas que operan en la biosíntesis y degradación de la glucosilceramida, el glicoesfingolípido que se acumula en el caso de la enfermedad de Gaucher. En colaboración con los Profesores J. M. F. G. Aerts (Univ. Amsterdam) y H S. Overkleeft (Univ. Leiden), se ha determinado el aumento de la actividad intralisosomal en fibroblastos de Gaucher tras el tratamiento con las chaperonas, haciendo uso de ¿sondas de actividad¿ etiquetadas con marcadores fluorescentes. En ambas series se han identificado compuestos con buenas perspectivas para su utilización en el tratamiento de las patologías de GD. La parte central de la Tesis se centra en el diseño de inhibidores específicos de la a-galactosidasa (a-Gal A) y de la b-galactosidasa (b-Gal) lisosomales susceptibles de desarrollo como chaperonas farmacológicas para el tratamiento de la enfermedad de Fabry y de la gangliosidosis GM1, respectivamente. Hemos demostrado que la especifidad de acción de iminoazúcares sp2 derivados de la 1-desoxigalactonojirimicina (DGJ) puede dirigirse hacia una u otra enzima actuando sobre la estructura del esqueleto de iminoazúcar: derivados monocíclicos presentan una elevada selectividad hacia a-Gal A en tanto que derivados bicíclicos lo hacen hacia la b-Gal. Este cambio en la selectividad está gobernado por interacciones no glicónicas de carácter hidrófobo que, a su vez, requieren una orientación definida del sustituyente exocíclico sobre el grupo pseudoamida. En colaboración con los grupos de los Profesores Y. Suzuki (Univ. Otawara), K. Ohno y K. Higaki (Univ. Tottori, Japón), se ha evaluado el potencial como chaperonas farmacológicas de los nuevos derivados tanto in vitro en fibloblastos humanos y en células COS que expresan mutaciones de FD o GM1 como, en el caso de la GM1, in vivo en ratones genéticamente modificados. Los resultados demuestran la capacidad de las chaperonas desarrolladas de cruzar la barrera hematoencefálica y reducir el acúmulo de glicoesfingolípidos en el cerebro, revirtiendo de esta manera la enfermedad a nivel del tejido neuronal. Dado que una chaperona farmacológica eficaz debe de unirse fuertemente a la enzima diana en el retículo endoplasmático (pH 7.3) pero disociarse en el lisosoma (pH 5.2), hemos explorado la incorporación de un grupo ortoéster, sensible al pH, en el diseño de una nueva generación de iminoazúcares sp2 derivados de DNJ y DGJ. Este grupo conecta el núcleo de iminoazúcar con el sustituyente hidrofóbico, de manera que la hidrólisis a pH 5.5 o inferior conduce a una pérdida importante de afinidad. El concepto se ha aplicado a la preparación de chaperonas farmacológicas para GD y FD. Nuestro interés en nuevas aproximaciones para modular la potencia y selectividad de los iminoazúcares como inhibidores de glicosidasas, con miras a sus aplicaciones en diferentes patologías, nos ha llevado a explorar el efecto de una presentación multivalente en sus propiedades de inhibición. En colaboración con los grupos de los Profesores P. Compain y J.-F. Nierengarten (Univ. de Estrasburgo), se han preparado multiconjugados de DNJ o DMJ basados plataformas de fullereno-C60 o b-ciclodextrina (bCD). Se han observado modificaciones significativas en el perfil de afinidad hacia diferentes enzimas que son función de la valencia y de la arquitectura tridimensional del sistema. El resultado más llamativo es el aumento de hasta cuatro órdenes de magnitud en la potencia de inhibición de la a-manosidasa (a-Manasa) de judía Jack, una enzima estructuralmente relacionada con las a-Manasas lisosomal y de Golgi humanas, para un conjugado tetradecavalente de DNJ-bCD. Estos estudios han conducido a formular la existencia de un efecto inhibidor multivalente. En la Tesis también se aborda el desarrollo de nuevas metodologías de síntesis de iminoazúcares de la familia de las pirrolidinas y análogos de 2-acetamido-1,2-didesoxiazúcares. Estos trabajos se han realizado en colaboración con los grupos de los Profesores G. W. J. Fleet (Univ. Oxford) y A. Riera (Univ. Barcelona) y han permitido acceder a derivados de la serie L en el primer caso y a la primera síntesis de la 2-acetamido-1,2-didesoxialonojirimicina (DAJNAc), un inhibidor potente de la b-glucosaminidasa (b-GlcNAcasa) de placenta humana, en el segundo.