Caracterización de rizobios aislados de leguminosas del suroeste de Andalucía e implicación del gen NOLG en la simbiosis de ensifer meliloti ort12 - medicago sativa

Abstract

El Parque Natural Marismas del Odiel y el Paraje Protegido de Río Tinto son áreas protegidas por la Junta de Andalucía donde se desarrollan especies de gran importancia, pero que históricamente han sufrido importantes procesos de contaminación natural por la actividad minera en la zona y por el dragado de los ríos. En esta Tesis se han recolectado leguminosas como Ornithopus compressus, Lotus corniculatus, Medicago sp. Medicago marina, Medicago polymorpha y Tripholium sp., de esas zonas, y se han hecho aislamientos de los nódulos de sus raíces. Paralelemente se han realizado análisis fisicoquímicos de los mismos suelos para conocer su composición, contenido en NaCl, conductividad, pH y presencia de metales pesados. Se han estudiado en profundidad un total de 47 aislamientos diferentes en cuanto a su tolerancia a altas concentraciones salinas, pH extremos, propiedades promotoras del crecimiento vegetal. Estos resultados mostraron el gran interés que presentaban los aislamientos de la planta M. marina, por ser los más tolerantes a altas concentraciones salinas, capaces de crecer a pH alcalino, buenos solubilizadores de fosfato, así como productores de AIA. Por todo ello, así como por el interés de esta planta tolerante a la sal, se realizaron nuevos aislamientos de una población de M. marina situada en las dunas de la playa de San Fernando (Cádiz). Se analizaron en profundidad 30 estirpes diferentes aisladas de nódulos de M. marina, en relación a sus propiedades fisiológicas, (utilización de diversos azúcares como única fuente de carbono, tolerancia a ciertos antibióticos, al NaCl, a los metales pesados, a la temperatura y el pH), a sus características moleculares (PCR-RFLP de las regiones intergénicas IGS con dos endonucleasas, análisis de la secuencia del gen ARNr 16s y del gen nodC, perfil de plásmidos, perfil de lipopolisacáridos, además de una secuenciación parcial del gen housekeeping glnII y del gen simbiótico nodA de ciertos aislamientos representativos). Paralelamente se han estudiado parámetros simbióticos como la eficiencia en plantas de M. marina, M. murex, M. orbicularis, M. polymorpha, M. sativa y M. truncatula. Con estos estudios se determinó que todas las bacterias aisladas los nódulos de M. marina pertenecían a la especie E. meliloti simbiovariedad meliloti, excepto una de ellas que pertenecía a E. medicae. Paralelamente, para determinar el rango de simbiontes de M. marina, se llevaron a cabo ensayos de nodulación con 10 especies diferentes de Ensifer, siendo E. kummerowiae CCBAU 71714 la única que formó nódulos fijadores. La mayoría de los aislamientos de M. marina mostraron tolerancia a factores de estrés entre ellos tolerancia a determinados metales pesados. Para determinar el mecanismo molecular de dicha tolerancia se seleccionó el gen nolG, que codifica una bomba de resistencia a multidrogas (MDR) de tipo RND (resistencia nodulación y división celular) que puede estar implicada en la expulsión de metales pesados del interior celular, pero de la que se desconocen los sustratos que transporta y su posible implicación simbiótica. Para ello se realizaron mutantes en el gen nolG de dos de los aislamientos de M. marina (E. meliloti SVQ747 y E. medicae SVQ748). Los mutantes de la especie E. meliloti no presentaron fenotipo en cuanto a la tolerancia a metales pesados. Sin embargo, estos mutantes fueron claramente más competitivos por la nodulación de M. sativa que la cepa parental, además de tener una mayor capacidad colonizadora de las raíces de alfalfa en los primeros días y presentar un mayor porcentaje final de plantas noduladas. Al contrario, los mutantes nolG de E. medicae SVQ748, presentaron una menor tolerancia a metales pesados como cadmio y cinc, y no fueron más competitivos que la estirpe silvestre para la nodulación de la planta. Por lo que, aunque no se ha podido determinar claramente la implicación de nolG de E. meliloti SVQ747 en la resistencia a metales pesados, sí que tiene un claro papel en la simbiosis entre E. meliloti y M. sativa.