Riesgos tóxicos por cianotoxinas en peces de consumo : optimización de métodos de análisis, potenciales mecanismos de toxicidad y tratamiento

Abstract

Las cianobacterias han ido adquiriendo gran importancia a lo largo de los años debido a su capacidad de formar floraciones o ¿blooms¿, las cuales pueden llegar a ser tóxicas debido a la producción de cianotoxinas, por lo que se han convertido en una preocupación a nivel mundial en materia de contaminación ambiental, toxicológica, sanitaria y económica, ya que pueden afectar tanto a animales y plantas como a seres humanos. De todas las cianotoxinas, y dado que son las únicas que han causado fenómenos masivos de intoxicación en poblaciones humanas, merecen especial atención las Microcistinas (MCs) y la Cilindrospermopsina (CYN), constituyendo esta última el principal objeto de estudio de la presente Tesis Doctoral. Por todo ello, decidimos realizar una serie de estudios para investigar, en primer lugar, los efectos que pueden tener diferentes técnicas usuales de cocinado en las concentraciones de MCs en el pescado contaminado destinado al consumo humano. En el caso de la CYN, en primer lugar, nos pareció importante la puesta a punto y validación de métodos analíticos para cuantificar la toxina en diferentes matrices, y posteriormente decidimos profundizar en su mecanismo de toxicidad y sus efectos tóxicos, así como estudiar alternativas que nos permitieran contrarrestar los daños producidos por dicha toxina. Asimismo, también estudiamos su distribución en tejidos de peces contaminados. Todo ello en una de las especies acuáticas de consumo humano que pueden verse afectadas por esta toxina en su hábitat natural, como es el pez tilapia (Oreochromis niloticus). Por otra parte, también se ha abordado, mediante proteómica, el estudio del repertorio de Glutatión-S-transferasas (GSTs) en branquias de bivalvos, y los efectos de la CYN sobre plantas de consumo humano, como son las zanahorias (Daucus carota), expuestas a la toxina mediante el agua de riego. Una de las vías de exposición a MCs más importantes es la vía oral. Además, las MCs pueden bioacumularse en organismos acuáticos, pudiendo ser transferidas a lo largo de la cadena trófica hasta los escalones más altos, y llegando así a los seres humanos, por lo que el consumo de estos animales acuáticos contaminados representa un riesgo potencial para la salud humana. Así, una correcta evaluación de riesgos de la exposición humana a MCs a través de los alimentos requiere de un detallado conocimiento acerca de la influencia del procesado y cocinado del alimento sobre estas toxinas. Es por ello que nos propusimos investigar los posibles cambios en la concentración de MCs libres en músculo de tilapias (Oreochromis niloticus) (porción comestible) a las que se les añadió una mezcla de MCs puras (MC-LR, MC-RR y MC-YR), conteniendo 1,5 µg/mL de cada toxina, y sometidas posteriormente a dos técnicas de cocinado habituales, como son el horno microondas y el hervido en dos modalidades. Se ha comprobado que ambas técnicas de cocinado son capaces de reducir los niveles de MCs libres en el pescado (Oreochromis niloticus) en un rango entre 25-50%, siendo mayor con el hervido continuo en el caso de la MC-RR. Concretamente, el hervido continuo ha demostrado ser el más eficaz, debido tal vez al mayor tiempo de permanencia de la muestra en el agua. Asimismo, tras detectar MCs en el agua de hervido, mostramos que existe un riesgo adicional inherente a la utilización de esta agua para hacer sopas de pescado. En general, estas técnicas podrían ser consideradas como medidas de control de estas toxinas en la dieta tras el consumo humano de los alimentos cocinados. Los resultados de este experimento han dado lugar a la siguiente publicación: EFFECTS OF THERMAL TREATMENTS DURING COOKING, MICROWAVE OVEN AND BOILING, ON THE UNCONJUGATED MICROCYSTIN CONCENTRATION IN MUSCLE OF FISH (OREOCHROMIS NILOTICUS). (Guzmán-Guillén y col., 2011. Food and Chemical Toxicology 49, 2060-2067). La monitorización de CYN en medios contaminados por cianobacterias es de gran importancia para evaluar los riesgos que supone su exposición para la salud y el medioambiente. Las técnicas analíticas empleadas para detectar y cuantificar esta toxina, tanto en aguas como en otras matrices, son de diverso fundamento y complejidad (ELISA, LC-DAD, LC-MS y LC-MS/MS). Sin embargo, no todos estos métodos ofrecen la misma sensibilidad. La LC-MS/MS ha sido elegida como el método ideal y de referencia para detectar y cuantificar pequeñas cantidades de toxina en muestras de agua (Eaglesham y col., 1999; Bogialli y col., 2006; Oehrle y col., 2010) y en muestras más complejas, como tejidos de peces (Gallo y col., 2009) o muestras de suero y orina humanas (Foss y Aubel, 2013). Por ello nos propusimos poner a punto y validar diferentes métodos cuantitativos, incluyendo ensayos de robustez, para la determinación de CYN en distintas matrices (aguas, cultivos de cianobacterias y tejidos de peces contaminados con CYN) por LC-MS/MS. Con el empleo de cartuchos de carbón grafitizado se obtuvieron resultados fiables en la extracción de CYN a partir de aguas y de cultivos de cianobacterias, usando una mezcla acidificada de diclorometano:metanol como disolvente. En el caso de los tejidos de peces (hígado y músculo), mediante un sistema SPE de doble cartucho (uno de C18 y uno de carbón grafitizado) conseguimos extractos limpios que permitieron la recuperación de la toxina en un alto porcentaje (80-110%). Por tanto, los métodos que proponemos han sido adecuadamente validados: con amplios rangos de concentraciones de CYN, límites de detección y cuantificación aceptables (que en el caso del agua, permiten la determinación de la toxina por debajo del valor guía propuesto por la OMS de 1 µg/L), recuperaciones en el intervalo 80-110%, y valores adecuados de precisión según la guía AOAC (Association of Official Analytical Chemists). Asimismo, la combinación de factores variables en la metodología demostró la robustez de los métodos propuestos para poder ser reproducidos bajo diferentes condiciones sin sufrir variaciones significativas en los resultados. Los métodos desarrollados en esta Tesis Doctoral pudieron ser aplicados con éxito y rapidez posteriormente para el análisis de CYN en las diferentes matrices estudiadas (aguas y matrices biológicas), permitiendo un control de la exposición, degradación, transferencia y bioacumulación de la CYN.