Monitorización óptica de la liberación de vesículas sinápticas únicas en neuronas de hipocampo en cultivo

Abstract

Los objetivos que persigue la Tesis Doctoral son: 1. Puesta a punto de un sistema de detección con sondas fluorescentes de la transmisión sináptica. Utilizaremos neuronas transfectadas con proteínas de las vesículas sinápticas fluorescentes unidas a sensores de pH como la Sinaptobrevina-pHluorina y Sinaptofisina-pHluorina. 2. Cuantificación y análisis de la transmisión sináptica mediante la medida de la intensidad de fluorescencia de los botones sinápticos de las neuronas de hipocampo. Utilizaremos un sistema de microestimulación al objeto de simular las condiciones de estimulación más fisiológicas posible. 3. Maximizar la detección óptica de la liberación de eventos únicos utilizando el plásmido SypHy al objeto de poder identificar eventos únicos de fluorescencia correspondientes a la fusión de una única vesícula sináptica. 4. Determinación de los parámetros funcionales conducentes al análisis cuántico de la liberación de neurotransmisor. 5. Estudio de la dependencia del calcio extracelular de la transmisión sináptica. 6. Estudio comparativo de la respuesta de liberación con sondas fluorescentes y con colorantes del tipo FM. Para ello se instalará un sistema de detección doble (Dualview) que nos permite separar la señal de fluorescencia en verde y en rojo. 7. Estudio de la respuesta de los mismos botones teñidos con colorantes de membrana FM 4-64 y botones transfectados con proteínas fluorescentes sensibles a pH.|