Implicación del extremo C-terminal de la fosfoenolpiruvato carboxilasa en la degradación y fosforilación de la proteína

Abstract

En este trabajo hemos identificado y caracterizado parcialmente una nueva proteasa que degrada a la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC), proteína objeto de nuestro estudio. Esta enzima no requiere Ca2+ ni metales para su actividad y es parcialmente sensible a quimostatina, considerado co ... mo un inhibidor de serín-cisteín proteasas. Sin embargo, posee la peculiaridad de ser activa sólo en presencia de un péptido de características hidrófobas y que representa los últimos 19 aminoácidos del extremo C-terminal de la PEPC de sorgo de tipo C4 (péptido C19). Hemos identificado el sitio de interacción mostrando que el tretapéptido final QNTG no es necesario para la activación de la proteasa, mientras que las Thr944 y Thr948 son aminoácidos esenciales para la activación. También hemos mostrado la especificidad de este péptido ya que, otras secuencias de PEPC (péptidos L1, L2 y L3) no tienen ningún efecto como activadores de esta proteasa. Adicionalmente, la proteasa C19 (nombre que hace alusión al péptido que la activa) puede degradar otros sustratos como la caseína pero aún así su actividad sigue siendo absolutamente dependiente del péptido C19. Además, hemos observado que en presencia de glucosa-6P, activador alostérico de la PEPC, se produce una inhibición de la degradación de la PEPC por la proteasa C19. Este resultado es muy interesante ya que indica que la degradación de la PEPC por la proteasa C19 puede ser regulada por metabolitos. El efecto de la glucosa-6P sería indirecto a través de cambios conformacionales en la PEPC. Otras características de esta proteasa son su amplio rango de pH óptimo desde 6,5 hasta 8,5, y un peso molecular aproximado de 50 kDa. En cuanto a los sitios de corte de la proteasa C19 sobre la PEPC hemos puesto en evidencia otro importante resultado. La proteasa C19 empieza su proteólisis por el extremo N-terminal de la PEPC pues en presencia de un péptido sintético que simula dicho extremo y que contiene además el motivo de fosforilación (Chollet et al. 1996) la proteólisis es inhibida, cosa que no ocurre cuando se utiliza el mismo péptido pero fosforilado en la Ser8. Este resultado aporta una nueva perspectiva del mecanismo de regulación de la PEPC por fosforilación reversible, el cuál hasta el momento sólo se pensaba que regulaba las propiedades cinéticas y de regulación de la PEPC. Nosotros aportamos en este trabajo, por primera vez, que la fosforilación de la PEPC regula también la degradación de la proteína por la proteasa C19. Otros datos de interés sobre la movilidad del extremo C-terminal de la PEPC, del cual se ha descrito in vitro que puede estar en dos conformaciones distintas, accesible o inaccesible según se describe en Á lvarez et al., (2003), muestran que hay dos posible reguladores fisiológicos de la exposición del C-terminal, la glucosa-6P que lo esconde y el ácido fosfatídico (PA) que lo expone. De esto se deduce que la conformación de la PEPC en presencia de glucosa-6P es una conformación protegida de la proteólisis (como se ha descrito anteriormente), mientras que en presencia de PA adoptaría una conformación en la que la proteólisis estaría favorecida. Los trabajos con el PA nos han permitido demostrar que la proteasa puede ser activada por el propio extremo C-terminal de la PEPC. En efecto, el PA induce la exposición del C-terminal de la PEPC y promueve su proteólisis por la proteasa C19 sin necesidad de la presencia del péptido C19, y al igual que en el mecanismo descrito anteriormente el punto inicial de corte se localiza en el dominio N-terminal de la PEPC. Finalmente, aportamos evidencias de que el péptido C19 es un inhibidor de la PEPC-quinasa, describiendo el mecanismo antes sólo sugerido en Á lvarez et al., (2003). En su conjunto estos resultados indican que la regulación de la movilidad del C-terminal podría depender in vivo de la presencia de metabolitos como la glucosa-6P o de mensajeros secundarios como el PA. En presencia de glucosa-6P, la PEPC escondería el C-terminal promoviendo la actividad y la fosforilación y desfavoreciendo la proteólisis de la PEPC, preparándose esta para ser eficaz en el contexto metabólico donde sea requerida, como por ejemplo, la fotosíntesis C4. Dado que el incremento de PA en la célula está con frecuencia asociado a condiciones de estrés nos encontraríamos con un modelo eficaz de reajuste de los niveles de PEPC promoviendo la proteólisis. Además, en presencia de PA se favorece la exposición del C-terminal con lo que se inhibiría la fosforilación. Todos estos resultados dibujan por primera vez un mapa totalmente nuevo de regulación de la PEPC a través de la movilidad del extremo C-terminal de la proteína que a su vez regularía la fosforilación y la degradación de la proteína por la proteasa C19.