González Aguilera, CristinaBruno, Federica2025-02-192025-02-192024-11-28Bruno, F. (2024). Effect of Chromatin Replication on RNA Polymerase II Activity and RNA synthesis. (Tesis Doctoral Inédita). Universidad de Sevilla, Sevilla.https://hdl.handle.net/11441/169009In the nucleus of the eukaryotic cell, the genetic material is organized in the form of chromatin where DNA associates with nucleosomes, formed by an octamer of histone proteins, to provide the correct environment to regulate gene expression, maintain cellular identity and avoid disease. Despite the important role of chromatin organization in cellular function, in each cell division chromatin is totally disorganized. Nucleosomes are evicted ahead of the replication fork and will have to be recycled together with newly synthetized histones to maintain nucleosome density in the two daughter strands. This disorganization produces changes in chromatin accessibility and a dilution in epigenetic information. To date, it is not clear how these chromatin and epigenetic changes can affect gene expression. In this thesis, we have used the cutting-edge Chromatin Occupancy after Replication and sequencing (ChOR-seq) and Chromatin-associated RNA-seq (ChrRNA-seq) techniques to analyze the activity of RNA Polymerase II (RNAPII) and the synthesis of newly transcribed RNA during the first hours after chromatin replication in human cells. We found that transcription was re-established very fast after the passage of the replication fork, even when chromatin organization was not completely restored. However, this movement over non-restored chromatin causes a transient drop in RNAPII abundance and changes in its distribution, resulting in heterogeneous alterations in RNA synthesis. RNA synthesis alterations include quantitative changes affecting mainly small genes and changes in alternative splicing affecting large genes related with development and signaling pathways. Finally, we also demonstrate that the aberrant alternative splicing events produced in nascent chromatin were linked to codirectional collisions between the transcription and replication machineries. Together, our results reveal molecular mechanisms showing how DNA replication is a significant source of transcriptional variability. Moreover, our data help to understand how changes in cellular identity can be regulated, which are key elements in physiological processes such as cell differentiation and tissue regeneration as well as in pathological conditions like cancer disease.En el núcleo de la célula eucariota, el material genético se organiza en forma de cromatina, donde el ADN se asocia con un octámero de proteínas llamadas histonas para formar el nucleosoma. Esta estructura proporciona estabilidad y el ambiente adecuado para regular la expresión génica permitiendo un correcto mantenimiento de la identidad y función celular. A pesar del crucial papel de la organización de la cromatina en el metabolismo celular, cada vez que la célula se divide la cromatina se desorganiza por completo, requiriendo varias horas para restaurarse. No obstante, no está claro cómo estas reorganizaciones afectan la regulación génica y al mantenimiento de la identidad celular. En esta tesis, utilizamos las técnicas Chromatin Occupancy after Replication y sequencing (ChOR-seq) y Chromatin-associated RNA-seq (ChrRNA-seq) para analizar la actividad de la ARN Polimerasa II (RNAPII) y la síntesis del ARN recién transcrito durante las primeras horas después de la replicación de la cromatina en células humanas. Nuestros datos revelaron que la transcripción se reactiva rápidamente en la cromatina recién replicada, aun cuando su organización no está completamente restaurada. Eso produce que la abundancia de RNAPII disminuya en la cromatina naciente y su distribución se vea alterada, generando caídas heterogéneas en la síntesis de ARN. Sin embargo, identificamos que este movimiento sobre la cromatina no restaurada causa una disminución transitoria en la abundancia de RNAPII y cambios en su distribución, lo que resulta en alteraciones heterogéneas en la síntesis de ARN. Las alteraciones en la síntesis de ARN incluyen cambios cuantitativos que afectan principalmente a genes pequeños y cambios en el splicing alternativo que afectan a genes grandes relacionados con el desarrollo y las vías de señalización. Finalmente, también demostramos que los eventos aberrantes de splicing alternativo que se producen en la cromatina naciente estaban vinculados a colisiones codireccionales entre las maquinarias de transcripción y replicación. En conjunto, nuestros resultados revelan mecanismos moleculares que muestran cómo la replicación del ADN es una fuente significativa de variabilidad transcripcional. Además, nuestros datos ayudan a entender cómo se pueden regular los cambios en la identidad celular, que son elementos clave en procesos fisiológicos como la diferenciación celular y la regeneración de tejidos, así como en condiciones patológicas como la enfermedad del cáncer.application/pdf167 p.engAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internationalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccess