Aguilera López, AndrésGómez González, BelénMarqueta Gracia, José Javier2025-03-052025-03-052024-11-22Marqueta Gracia, J.J. (2024). DNA break prevention and repair: role of RNA factors and histone deacetylases. (Tesis Doctoral Inédita). Universidad de Sevilla, Sevilla.https://hdl.handle.net/11441/169617Con el objeto de identificar los factores que eviten la formación de roturas de doble cadena promovidos por conflictos entre la transcripción y la replicación, hemos realizado y un escrutinio con una colección de ARN interferentes. La selección de candidatos la hemos basado en la intensidad de gH2AX como marca de roturas de ADN. Para ello, hemos utilizado una línea celular que hemos generado para expresar de manera inducible la enzima citidina desaminasa que, en última instancia, provoca roturas en la cadena sencilla desplazada de los R loops, así pues, sirve como herramienta para la detección indirecta de R loops. Con esta aproximación, hemos identificado 21 genes potencialmente implicados en la prevención de inestabilidad genómica asociada a R loops. Entre ellos, destaca la helicasa de ARN UPF1, la cual hemos procedido a estudiar en profundidad. Así, hemos observado que el silenciamiento de UPF1 da lugar a un aumento de roturas de doble cadena de ADN, que va acompañado de un aumento de R loops. El mecanismo por el cual UPF1 previene o resuelve este tipo de estructuras está todavía pendiente de estudio, pero hemos validado el resultado obtenido por el escrutinio, confirmado su implicación en el mantenimiento de la homeostasis de los híbridos. Con el objeto de determinar el papel de las deacetilasas de histonas, proteínas capaces de modificar el estado de la cromatina, en la reparación de roturas de doble cadena, hemos desarrollado y validado nuevos sistemas de inducción de roturas. La expresión de la endonucleasa Cas9 en una línea celular inducible dirigida a las secuencias repetitivas Alu y LINE-1, mediante guías de ARN, genera roturas de forma masiva a lo largo del genoma. Hemos confirmado que las roturas de doble cadena mediadas por Cas9 en las secuencias LINE-1, permiten analizar el papel de los factores de reparación mediante diferentes técnicas moleculares y celulares. Por otro lado, hemos puesto a punto un sistema para inducir roturas por la endonucleasa de restricción I-SceI en una línea celular que además permite cuantificar el producto de reparación generado por la ruta de unión de extremos no homólogos. Utilizando ambos sistemas y técnicas convencionales para inducir roturas de doble cadena, demostramos que el silenciamiento de HDAC1 y no de otras deacetilasas de histonas de la clase I (HDAC2 y HDAC3) afecta a la señalización de gH2AX. Además, las células deficientes en HDAC1 tienen defectos parciales en la cohesión y menor eficiencia de recombinación con la cromátida hermana. El defecto en la señalización podría ser causante de la alteración observada en el reclutamiento de otras proteínas de reparación como MRE11, KU70 y RPA70 tras el silenciamiento de HDAC1. Como consecuencia, se produciría tanto el defecto en la recombinación con la cromátida hermana como en la reparación por unión de extremos no homólogos que provocan un aumento de la inestabilidad genómica y un descenso de la viabilidad celular. En conjunto, los resultados de esta tesis nos han permitido identificar nuevos factores que previenen la formación o facilitan la reparación de roturas de ADN de doble cadena. En concreto, la helicasa de ARN UPF1 evita o resuelve la formación de R loops causantes de una gran parte de los conflictos entre la transcripción y la replicación, mientras que la deacetilasa de histonas HDAC1, actúa como un mediador en la reparación de roturas de doble cadena facilitando la señalización de daño mediante la marca epigenética gH2AX.application/pdf244 p.engAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internationalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccess