Valle Rosado, IvánPeña Gómez, Mª José2025-07-042025-07-042025-03-27Peña Gómez, M.J. (2025). Inestabilidad de la horquilla de replicación provocada por los intermediarios de la ruta de reparación por escisión de bases. (Tesis Doctoral Inédita). Universidad de Sevilla, Sevilla.https://hdl.handle.net/11441/175014Un eficiente proceso de replicación del ADN es esencial para el mantenimiento de la estabilidad del genoma. Sin embargo, la constante exposición a factores endógenos o exógenos que pueden desencadenar múltiples lesiones, obstaculizan la progresión de las horquillas de replicación, pudiendo generar estrés replicativo. Durante la evolución, las células han adquirido una compleja red de rutas de reparación especializadas en reparar estas lesiones genotóxicas. En esta tesis doctoral nos hemos centrado en dilucidar el papel de la ruta de reparación Anemia de Fanconi y de la ruta de reparación por escisión de bases, en el mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación tras la incorporación errónea de bases de ADN modificadas. Además de su función canónica en la reparación de uniones covalentes entre bases del ADN o en la eliminación de bases de ADN modificadas, se ha descrito que factores pertenecientes a estas rutas de reparación presentan un papel en el mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación ante estrés replicativo. En esta tesis doctoral se demuestra que la incorporación errónea de la 5-hidroximetil-2’-desoxiuridina (5hmdU), derivada de la 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina (5hmdC), desencadena una respuesta al daño en el ADN, la acumulación de aberraciones cromosómicas, altera la progresión de la horquilla de replicación y provoca la muerte celular en ausencia de los factores XRCC1 (perteneciente a la ruta de reparación por escisión de bases) o FANCD2 (perteneciente a la ruta de reparación Anemia de Fanconi). La exposición a 5hmdC incrementa los niveles nucleares de PAR, los cuales se usan como marcador subrogado de la presencia de huecos de ADN de cadena sencilla. Este incremento de huecos de ADN de cadena sencilla desencadena la inestabilidad de la horquilla de replicación y la letalidad observada en las células Xrcc1-/- o Fancd2-/-. Estos datos sugieren que durante el procesamiento de las bases hidroximetiladas mediante la ruta de reparación por escisión de bases, se generan intermediarios de reparación que desestabilizan la horquilla de replicación, requiriendo de estas rutas de reparación para su mantenimiento. Para demostrar que la acumulación de estos intermediarios de reparación pueden ser la causa de inestabilidad genómica y muerte celular observadas tras la incorporación de la 5hmdU, deplecionamos genéticamente factores de la ruta de reparación por escisión de bases en ausencia de FANCD2. La depleción de los factores implicados en la formación de sitios abásicos o cortes de cadena sencilla rescata los defectos de la horquilla de replicación y la viabilidad celular, mientras que la depleción de los factores que actúan aguas abajo a la formación de estos intermediarios exacerba la letalidad celular debida a la incorporación errónea de la 5hmdU. Los resultados obtenidos en la etapa final de esta tesis doctoral están relacionados con HMCES, un factor descrito recientemente que se une a los sitios abásicos localizados en la cadena molde de forma covalente para protegerlos del corte endonucleolítico mediado por APEX1. Hemos demostrado que la unión de HMCES a los sitios abásicos generados en la cadena de ADN naciente tras la eliminación de la 5hmdU, es responsable de los defectos de estabilidad de la horquilla de replicación, de la acumulación de huecos de ADN de cadena sencilla mediados por APEX1 y por PRIMPOL, de las aberraciones cromosómicas y de la letalidad celular observados en las células deficientes en FANCD2.application/pdf281 p.spaAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internationalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccess