dc.description.abstract | La piel es el principal órgano que actúa como defensa frente a
agresiones externas, protegiendo al organismo de sustancias tóxicas,
daño físico, e invasión por patógenos o radiaciones, suponiendo una
pieza indispensable del sistema inmunológico. En este sentido, la
perturbación de su estructura o función podría estar causada tanto por
factores externos, como sustancias tóxicas o radiación ultravioleta
(UV), o por factores internos, como pueden ser la predisposición
genética, desórdenes inmunitarios u hormonales, o estrés. Como
resultado de estas alteraciones, se puede desencadenar una respuesta
inflamatoria, una disminución de la respuesta inmune o un daño
oxidativo, entre otros.
La exposición crónica de la piel a la luz UV induce la
producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como una
respuesta inflamatoria, la cual juega un papel importante en el
fotoenvejecimiento, en el desarrollo de lesiones pre-cancerosas, como
la queratosis actínica, y en el cáncer de piel. Por otro lado, las
enfermedades inflamatorias de la piel tienen un alto impacto en la
calidad de vida de los pacientes; una de ellas es la psoriasis,
enfermedad crónica mediada por el sistema inmune, de afectación
predominantemente cutánea, cuya patogénesis no está clara aún. Hoy en
día, las estrategias para la protección de la piel se centran en el
uso de compuestos naturales para contrarrestar el estrés oxidativo y
la inflamación. En los últimos años, las microalgas han emergido como
fuente de compuestos bioactivos, incluyendo lípidos, proteínas,
polisacáridos y carotenoides. Estos compuestos han atraído el interés
de la industria farmacéutica y cosmética en base a sus actividades
como antioxidantes, anti-inflamatorios y anti-carcinogénicos.
En este estudio, hemos evaluado la actividad biológica de
ciertos glicolípidos y el carotenoide fucoxantina, aislados de la
especie Isochrysis galbana, así como del polifenol ácido rosmarínico,
en diferentes modelos inflamatorios de piel tanto in vitro como in
vivo, los cuales están desarrollados en los siguientes párrafos.
En primer lugar, hemos evaluado la actividad citotóxica,
antioxidante y fotoprotectora de diferentes glicolípidos aislados de la microalga Isochrysis galbana, empleando un modelo in vitro de
queratinocitos humanos HaCaT irradiados con UVB. El pre-tratamiento de
los queratinocitos con compuestos puros con estructuras de
monogalactosil-monoacilgliceroles (MGMGs) y digalactosildiacildigliceroles
(DGDGs), así como las fracciones ricas en
monogalactosil-diasilgliceroles (MGDGs) o DGDGs redujeron
significativamente el daño celular inducido por UVB, mediante la
disminución de la liberación de LDH, ROS y la producción de IL-6. Este
estudio preliminar nos permitió la selección de los compuestos más
activos, que fueron la fracción de glicolípidos MGDG y el glicolípido
puro MGMG-A, para su estudio posterior en modelos in vivo(Capítulo 1).
En el primer modelo in vivo, se estudiaron la fracción MGDG y el
glicolípido puro MGMG-A, en un modelo de hiperplasia epidérmica
inducida TPA en ratones Swiss CD-1. Son numerosas las evidencias que
muestran que la exposición de la piel a un activador de la proteína
kinasa C, como es el 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), induce
una respuesta pleiotrópica en el tejido, dando lugar al desarrollo de
lesiones macroscópicas como descamación y eritema, lo cual se asemeja
al fenotipo aparente de la psoriasis. En primer lugar, examinamos los
efectos anti-inflamatorios de la aplicación tópica de MGDG y MGMG-A,
disueltos en acetona (10 μg/μL, 200 μg por zona), comparándolos con la
Dex como compuesto de referencia. Los tratamientos se aplicaron en un
área delimitada de 1 cm2 en el dorso de los ratones y después de 30
minutos, se aplicó tópicamente el TPA (disuelto en acetona a 2 nmol
por zona), en las mismas áreas durante 3 días. Nuestros resultados
mostraron que el tratamiento con los glicolípidos disminuyó el edema,
el espesor de la epidermis y la producción de las citocinas proinflamatorias
TNF-α, IL-1β, IL-6 y IL-17.
Sin embargo, es sabido que la aplicación tópica de compuestos
requiere una adecuada incorporación de las moléculas bioactivas en una
fórmula que ofrezca estabilidad, que permita la permeación y que
permanezca el suficiente tiempo en la piel. En este sentido,
desarrollamos diferentes estudios de permeación in vitro, ex vivo e in
vivo, para comparar el perfil de tres formulaciones diferentes (gel,
pomada y crema). Los estudios in vitro y ex vivo se desarrollaron en
células de Franz y se completaron con un estudio de permeabilidad in
vivo, usando gel, pomada y crema con rodamina, lo que permitió evaluar
la estabilidad de las formulaciones y las propiedades de permeación de
las mismas a través de las capas de la piel. Los estudios de
permeabilidad mostraron que la crema era la formulación con el mejor perfil de permeación. Por tanto, estos resultados nos llevaron a
evaluar una crema que contenía la fracción MGDG (MGDG-crema) (0.2 %
p/p), en el modelo de hiperplasia en ratón, comenzando esta vez el
tratamiento 2 días antes de la primera aplicación de TPA. En
concordancia con la actividad anti-inflamatoria demostrada in vitro
con esta fracción, la aplicación de la crema disminuyó el edema
provocado por el TPA, mejoró los daños histopatológicos y redujo el
infiltrado celular. Cabe destacar que estos resultados fueron más
significativos con la aplicación de la crema que con la fracción
disuelta en acetona. Además, esta formulación inhibió la expresión
epidérmica de COX-2 de manera similar, alcanzando niveles similares a
la Dex. Por tanto, nuestros datos muestran por primera vez el efecto
preventivo de los glicolípidos en patologías inflamatorias de la piel
como la psoriasis y sugieren que la fracción formulada en crema podría
ser una interesante estrategia terapéutica para el tratamiento de esta
patología (Capítulo 2).
El siguiente estudio nos condujo a la evaluación del efecto
anti-inflamatorio, antioxidante y fotoprotector del carotenoide
fucoxantina (FX) aislado de Isochrysis galbana en modelos tanto in
vitro como in vivo. En primer lugar, la actividad anti-inflamatoria
fue evaluada en macrófagos THP-1 estimulados con LPS y en
queratinocitos HaCaT estimulados con TNF-α y la actividad antioxidante
en queratinocitos HaCaT irradiados con UVB (50 mJ/cm2). Nuestros
resultados mostraron una disminución de las citocinas proinflamatorias
TNF-α e IL-6, así como un efecto protector de la FX,
debido a la reducción de la producción intracelular de ROS y LDH.
Estos datos nos llevaron a evaluar el posible efecto preventivo de la
FX en dos modelos in vivo: un modelo de hiperplasia epidérmica
inducida por TPA en ratones Swiss CD-1, y un modelo de eritema agudo
inducido por UVB en ratones sin pelo SKH-1, expuestos a una
irradiación de 360 mJ/cm2. Con el objeto de evitar los efectos
negativos derivados del uso de disolventes como la acetona y de
aumentar la permeabilidad de la FX a través de la piel, se formuló una
crema que contenía el carotenoide (FX-crema) para su aplicación a los
animales (0.2 % p/p). Los resultados del modelo de TPA mostraron que
el pre-tratamiento con la FX-crema efectivamente mejoraba la
hiperplasia en ratón inducida por TPA, reduciendo significativamente
el edema de la piel, el espesor de la epidermis y la actividad de la
MPO, así como la expresión epidérmica de los niveles de COX-2. Por
otro lado, los datos obtenidos del modelo de exposición a UVB demostraron que la FX-crema reducía el eritema inducido por UVB en
ratón, así como el edema y la actividad MPO. Además, la crema con el
carotenoide inhibió la expresión de COX-2 en la piel expuesta a UVB,
así como aumentó la expresión de la proteína antioxidante HO-1, a
través de la regulación de la vía del Nrf2.Los resultados obtenidos en
todos los estudios realizados con la FX sugieren que este carotenoide,
vehiculizado en una formulación tópica para mejorar su permeación,
podría suponer una estrategia novedosa para prevenir las
exacerbaciones asociadas a la psoriasis y proteger a la piel de la
radiación UV(Capítulo 3).
En relación a los estudios con compuestos naturales, las plantas
siguen siendo hoy en día uno de los campos más prometedores para el
descubrimiento de nuevos compuestos que pueden conducir al desarrollo
de fármacos. En este sentido, los polifenoles son uno de los grupos
más estudiados; estos compuestos son metabolitos secundarios de las
plantas y generalmente, participan en los mecanismos de defensa de
éstas contra agresiones externas. Con más de 8.000 estructuras
diferentes conocidas, tienen como base común la presencia de uno o más
grupos fenólicos. La actividad anti radicales libres de esta familia
de compuestos ha sido ampliamente descrita, de hecho son los
antioxidantes más potentes que consumimos en nuestra dieta. Sin
embargo, la investigación en torno a ciertas propiedades todavía
continúa en desarrollo. En este sentido, la actividad antiinflamatoria
es una de las más importantes. Por lo tanto, en nuestro
siguiente estudio evaluamos el efecto de un compuesto polifenólico, el
ácido rosmarínico (RA) en un modelo de psoriasis inducida por
Imiquimod (IMQ). El IMQ es un agonista de los receptores Toll-like 7 y
8, cuya aplicación tópica en el dorso de ratones Balb/c durante 6
días, induce una inflamación acompañada de alteraciones típicas de la
psoriasis. Debido a que la efectividad del RA aplicado por vía tópica
puede ser limitada por su baja liposolubilidad y estabilidad, así como
su facilidad para oxidarse o degradarse con la luz, hemos usado
nanoliposomas (NL) para encapsular dicho polifenol. El pre-tratamiento
tópico con RA en gel y RA encapsulado en NL disueltos en gel (ambos a
0.2 % p/p) 30 minutos antes de la aplicación del IMQ (62.5 mg por zona
durante 6 días consecutivos) inhibió el daño macroscópico y el peso
del punch obtenido de la piel afectada, sugiriendo la reducción del
edema de la piel, la infiltración neutrofílica, la actividad de la MPO
y la expresión de citocinas pro-inflamatorias como TNF-α, IL-1β, IL-6
e IL-17. El RA en gel mostró mejores resultados que el RA encapsulado
en NL, esto podría ser debido a que la constante de disociación (pka) del RA a pH fisiológico afecta a la liberación de este compuesto desde
los NL al medio celular, y consecuentemente, reduce su actividad
biológica. En este sentido, al confirmar que la estructura química del
RA influye en la actividad final de la formulación, sería necesaria
una encapsulación específica para este tipo de compuestos.
Contribuyendo con estos resultados al uso de estos sistemas en la
industria farmacéutica, puesto que suponen una esperanzadora
herramienta como sistemas de liberación de fármacos vía tópica, debido
a su efectividad para favorecer la permeación y llevar el fármaco
hasta ciertas zonas de la piel (Capítulo 4).
Por último, evaluamos un posible sinergismo entre los
principales compuestos empleados en esta tesis, FX y RA. Para ello, se
ensayaron en un modelo de queratinocitos HaCaT irradiados con UVB (100
mJ/cm2) con el objetivo de elucidar su mecanismo de acción y determinar
si una mezcla de los mismos (5 μM de FX + 5 μM de RA) podría mejorar
sus actividades biológicas. En este estudio se determinó la viabilidad
celular, el ciclo celular, y la inducción de apoptosis, así como se
evaluaron mediadores implicados en la activación del inflamasoma. La
mezcla de estos compuestos demostró un mejor efecto fotoprotector y
antioxidante que los compuestos por separado, disminuyendo la muerte
celular, con el consecuente aumento de la viabilidad celular, y
reduciendo la apoptosis y los niveles de ROS inducidos por la acción
del UVB. Además, la mezcla moduló la respuesta inflamatoria
disminuyendo la expresión de los componentes del inflamasoma como son
el NLRP3 y ASC, y aumentando la expresión de los niveles de la
proteína antioxidante HO-1, mediante la regulación de la vía del
Nrf2(Capítulo 5).
En conclusión, nuestros estudios in vitro e in vivo han
demostrado los efectos beneficiosos de varios productos naturales,
entre los que destaca la FX y el RA, en enfermedades de base
inflamatoria, asociadas tanto a la exposición UVB como a patologías
mediadas por el sistema inmune como la psoriasis. Sus mecanismos de
acción podrían estar envueltos en la prevención del estrés oxidativo a
través de la activación de la vía Nrf2 y la reducción de la
inflamación mediante la regulación del inflamasoma y otras citocinas
relacionadas con la vía del NF-κB. Por esta razón, estos compuestos
podrían suponer moléculas prometedoras para su posible incorporación
en productos para el cuidado de la piel como por ejemplo protectores
solares, cremas anti-edad o regeneradoras, o formulaciones tópicas
para el tratamiento de patologías inflamatorias como la psoriasis. | es |