Mecanismos de adherencia de pseudomonas aeruginosa a nuevos biomateriales de uso médico

Abstract

En 1882 Gessard aisló por primera vezPseudomonas aeruginosa (Bacillus pyoceaneus) de muestras procedentes de heridas quirúrgicas. Hasta 1947 sólo se conocían 91 casos de bacteriemia por este microorganismo, pero en la década actual, cien años después de su descripción,Pseudomonas aeruginosa, ha pasado a ser un microorganismo de creciente interés en patología humana debido a su estrecha relación con enfermos inmunodeprimidos y hospitalizados, su resistencia a muchos antimicrobianos y la alta relación mortalidad/incidencia en muchas infecciones, en ciertos casos superior al 90%. El género Pseudomonasestá incluido en la familiaPseudomonadaceae e incluye bacilos gram negativos de 1-3 x 0.5-1 micras, rectos o ligeramente incurvados, móviles, aerobios (si bien, a veces, arginina y nitrato pueden permitir el crecimiento anaerobio), productores de catalasa y con frecuencia de oxidasa. Son microorganismos de vida libre; algunas especies son patógenas para el hombre, los animales o las plantas. La especie de mayor importancia en Microbiología Médica es Pseudomonas aeruginosa. Esta bacteria en medios sólidos habituales origina tres principales tipos de colonias: lisas, rugosas (ambas no mucoides) y mucoides, estas últimas en cultivos de secreciones respiratorias de pacientes con fibrosis quística y sólo ocasionalmente en otras circunstancias. La temperatura óptima de crecimiento es de 37ºC, pero este puede tener lugar entre 20ºC y 42ºC; sus requerimientos nutritivos son sencillos, siendo capaz de metabolizar una gran variedad de sustancias orgánicas. Ello permite al microorganismo sobrevivir, y aún multiplicarse, en líquidos y ambientes húmedos muy diversos. La proporción de población general portadora dePseudomonas aeruginosa en el tracto gastrointestinal y en piel/mucosas es baja, pero la administración de antimicrobianos (pacientes hospitalizados) aumenta el porcentaje de portadores. La transmisión persona-persona parece ser el modo más importante de diseminación del microorganismo. La importancia que los reservorios hospitalarios (fregaderos, respiradores, desinfectantes líquidos,…) y los alimentos juegan en la transmisión intrahospitalaria del microorganismo también debe tenerse en cuenta. De hecho, en la actualidad,Pseudomonas aeruginosa debe considerarse como una bacteria especialmente relacionada con la infección nosocomial, siendo responsable de casi la décima parte de todas las infecciones hospitalarias y de la mitad de las epidemias nosocomiales, sobre todo en casos de infecciones de heridas y quemaduras, infecciones del tracto respiratorio e infecciones del tracto urinario. Pseudomonas aeruginosa es resistente a muchos antimicrobianos. Hasta 1963 sólo la polimixina B y la colistina eran relativamente útiles en el tratamiento de infecciones por este microorganismo. En esa fecha apareció la gentamicina; algunos años después lo hizo la primera penicilina anti-Pseudomonas: la carbenicilina. La incorporación al arsenal terapéutico de nuevos aminoglucósidos (tobramicina, amicacina, netilmicina,…) betalactámicos (piperacilina, azlocilina, cefsulodina, ceftazidima, ceftizoxima, imipenema,…) y quinolonas (ciprofloxacina, ofloxacina, borfloxacina,…) ha aumentado las posibilidades terapéuticas a este microorganismos. La resistencia a los antimicrobianos depende en buena medida de la incapacidad de muchos de ellos para atravesar la membrana externa dePseudomonas aeruginosa, pero también de la producción de enzimas inactivantes (tanto de betalactámicos como de aminoglucósidos). El papel de las defensas del huésped es crucial frente a las infecciones por Pseudomonas aeruginosa. De todos los factores asociados a la infección porPseudomonas aeruginosa, el más importante es la existencia de neutropenia, al ser la fagocitosis el principal mecanismo de defensa frente a este microorganismo. Las infecciones porPseudomonas aeruginosa ocurren con poca frecuencia en individuos con estado inmunitario normal, en cambio, en pacientes inmunodeprimidos, aun a pesar del empleo de antimicrobianos activos “in vitro” la mortalidad es elevada. Las cepasPseudomonas aeruginosa, tanto las productoras de bacteriemia, como las aisladas de piel, tracto gastrointestinal y mucosas, no asociadas con enfermedad, son por lo común resistentes a la acción bactericida del suero. Los anticuerpos naturales anti-Pseudomonas,esencialmente del tipo IgM, poseen una capacidad opsonizante poco eficaz; el sistema complemento, en cambio, si tiene una gran capacidad de opsonización, potenciada por los anticuerpos específicos (mayoritariamente IgG) que aparecen tanto en animales inmunizados como en enfermos convalecientes. Se ha demostrado también la existencia de fagocitosis independiente de opsoninas, probablemente por la existencia de pili, estructuras de dominios altamente hidrófobos. En la actualidad existe muy poca información sobre el papel que la inmunidad celular juega en la defensa frente aPseudomonas aeruginosa. En sistemas acuáticos naturales, Pseudomonas aeruginosa crece formando biocapas, constituidas por microcolonias continuas. En principio, los microorganismos, como células aisladas, se dividen y crecen en una matriz de exopolisacáridos denominada glicocalix o “slime”, constituyendo microcolonias que finalmente originan biocapas coherentes. Una vez constituidas las biocapas, se liberan células capaces de colonizar otras superficies y formas así nuevas microcolonias. El material que constituye el “slime” es un exopolisacárido compuesto por una matriz dr alginato altamente hidratada (99% de agua). El alginato es un polímero aniónico de ácido gulurónico y ácido manurónico, ambos con sustituciones por grupos acetato o piruvato. Las moléculas se disponen en forma de cadenas lineales que irradian desde la superficie externa de la bacteria. A lo largo de la estructura de alginato los ácidos manurónico y gulurónico se disponen en dominios de uno u otro; la proporción de cada uno y la sustitución 0-acetil varía según las cepas, siendo posible establecer diferencias inmunológicas. El subcultivo repetido en gar de Mueller Hinton o en caldo nutritivo de una cepa mucoide en su primer aislamiento determina la aparición rápida de variantes no mucoides. Por el contrario, la incorporación a los medios de cultivo de antimicrobianos, surfactantes, o concentraciones adecuadas de Mg2+ y gluconato favorecen la estabilidad de las formas mucoides, como también sucede cuando el cultivo se realiza con agitación. Clásicamente se ha venido aceptando que la producción de “slime” es un fenómeno característico de las cepas mucoides pero en un trabajo reciente se ha puesto de manifiesto que tanto variantes no mucoides obtenidas por subcultivo de cepas mucoides, como cepas no mucoides desde un principio también producen “slime”. Ello ha llevado a considerar que la producción de exopolisacárido es una propiedad común a todas las cepas dePseudomonas aeruginosa, y que es la cantidad producida del mismo lo que realmente varía. La carga negativa del “slime” hace que este actúe como una resina de intercambio iónico capaz de absorber materiales quePseudomonas aeruginosa utiliza en su nutrición, al tiempo que protege al microorganismo de factores ambientales adversos, como anticuerpos, PMN y antimicrobianos. El núcleo de ácidos urónicos y los grupos 0-acetil están implicados en la capacidad de eliminación de radicales hipoclorito producidos por PMN activados. Experimentalmente también se ha demostrado que el “slime” inhibe la movilidad, la endocitosis y la formación de fagosomas. La actividad de que determinamos antimicrobianos puedan alcanzar el interior dePseudomonas aeruginosa, debe producirse una saturación del “slime”, por ello los antimicrobianos con menor carga positiva son los que más fácilmente podrán alcanzar el interior de la célula. El “slime” está también implicado en los procesos de adherencia dePseudomonas aeruginosa, a células del tracto respiratorio superior y a dispositivos de uso médico. El desarrollo de un cuadro infeccioso requiere una colonización previa por el correspondiente agente etiológico, cuyo primer paso será la adherencia del microorganismos, a una superficie del huésped parasitado. Los estudios sobre adherencia, bacteriana se iniciaron por Guyot, en 1908, estudiando la hemaglutinación producida por microorganismos; a partir de la década de los 50 se centraron en la interacción bacterias-células, y han alcanzado su auge en la última década, tras haberse sugerido la importancia patogénica de estos fenómenos en las enfermedades infecciosas. A estos estudios han venido a sumarse los de microbiólogos marinos sobre la importancia de la colonización bacteriana de corrientes marinas. Se viene aceptando que en la interacción bacterias-biomateriales existe un primer paso en el que se vencen fuerzas de naturaleza física (electrostáticas, hidrofóbicas,…) y de otro, irreversible, mediado por las interacciones e polímeros exopolisacárdios con la superficie del biomaterial. De acuerdo con la teoría de Derjaguin-Landau/Verwey-Overveek (Teoría DLVO) (sobre las interacciones entre objetos sumergidos en un líquido y las partículas en suspensión que existen en el mismo) una serie de fuerzas inespecíficas (gravedad, quimiotaxis, fuerzas de atracción de Londo-Van der Waals, atracción electrostática, tensión superficial) atraen partículas, mientras que otras (fuerzas de repulsión de Londo-Van der Waals, fuerzas de repulsión por obstáculo estérico, repulsión electrostática) las repelen. Como consecuencia del efecto conjunto una determinada partícula puede ocupar en un fenómeno conocido como adsorción; si las partículas logran vencer suficientemente las fuerzas de repulsión, quedarán ligadas a la superficie gracias a la acción de fuerzas de mayor intensidad (enlace covalente, puentes de hidrógeno, enlace iónico, hidrofobicidad) sobreviniendo lo que es ya conocido como adherencia. Algunos autores describen también un tercer estadío de colonización microbiana al que se conoce como coagregación, en el que los microorganismos, según los principios ya expuestos, se unen a otros que previamente han colonizado una superficie sólida. La hidrofobicidad de superficie y la carga eléctrica de superficie de las bacterias han sido los parámetros más estudiados de cuantos están implicados en estas interacciones iniciales. En un medio acuoso la hidrofobicidad de superficie de un microorganismo favorece su asociación estrecha a u sutrato hidrófono; de esta forma los microorganismos con superficie hidrófoba se unen más a células animales que los hidrófilos. Hay un gran número de circunstancias que influyen en la expresión de esta propiedad tales como el medio empleado para el cultivo, el crecimiento en reposo o en agitación, la realización de subcultivo repetidos y la fase y la temperatura de crecimiento; estos factores indirectamente, por tanto, pueden influir modulando la adherencia bacteriana. En cualquier caso la teoría DLVO sólo es una ayuda relativamente útil para comprender el fenómeno de la colonización en el ser vivo, donde una serie de factores adicionales como enzimas, anticuerpos e incluso antimicrobianos puedan alterar las interacciones entre bacterias y superficies. En la actualidad prácticamente cualquier persona llevará a lo largo de su vida algún dispositivo médico. Una de las complicaciones más serias que se derivan del empleo de estos dispositivos es la aparición de infecciones. Los dispositivos de uso médico como catéteres, sondas… de los que el médico ha podido disponer en el mercado se han fabricado con diferentes materiales sintéticos. En principio se usaron materiales que resultaron tener una elevad capacidad trombogénica o eran demasiado rígidos: polietileno, polipropileno, cloruro de polivinilo (PVC), nylon. Más tarde se han introducido los fluorocarbonos (Teflon), más hemocompatibles pero relativamente inelásticos. También se ha empleado el PVC con factores que permiten su ablandamiento (plastificantes como éster ftálico y otros aditivos) pero en concentraciones excesivamente altas, incluso del 50%, con el peligro de que estas sustancias añadidas al polímero base pueden liberarse con cierta facilidad ocasionando efectos tóxicos en el organismo. otro biomaterial de uso extendido es la silicona; esta sustancia posee una baja tensión superficial, es fuertemente hidrófoba pero demasiado blanda y mecánicamente débil por lo que se ha empleado casi sólo para fabricación de catéteres venosos centrales de pared gruesa que requieren largo tiempo de implantación y para el recubrimiento de otros biomateriales. En la actualidad se están introduciendo los poliuretanos, materiales con un número de propiedades que los hacen muy adecuados para la fabricación de cánulas y catéteres : buena hemocompatibilidad; son suficientemente rígidos para su inserción pero sufren en el interior de las venas un reblandecimiento, lo que conlleva una disminución de la irritación vascular y del desarrollo de flebitis; tienen una excelente combinación de velocidad de flujo/rigidez/resistencia a la torsión; buena radioopacidad y mayor facilidad para humedecer su superficie que PVC, silicona…, por lo que sus paredes podrían recubrirse con soluciones que contengan lubricantes, anticoagulantes, antimicrobianos… Algunos de los poliuretanos más modernos están, teóricamente al menos, libres de aditivos al sintetizarse mediante un proceso de polimerización en el que no se requieren catalizadores. Los estudios realizados sobre la adherencia bacteriana a catéteres y a otros dispositivos de empleo clínico como prótesis articulares y lentes de contacto, señalan la existencia de diferencias dependientes tanto del microorganismos como del biomaterial considerado. La mayoría de estos trabajos se han realizado conStaphylococcus(especialmente estafilococos coagulasa negativa),Enterobacteriaceae(Escherichia coli¸ Serratia marcescens…) y Pseudomonas aeruginosa. La especial capacidad dePseudomonas aeruginosa para colonizar superficies inertes, asociada a la producción in situ de “slime”, la convierten en uno de los microorganismos de mayor interés en este tipo de cuadros infecciosos. Los estudios realizados hasta la fecha sobre la adherencia dePseudomonas aeruginosa a biomateriales han sido puramente morfológicos, utilizando microscopia electrónica de barrido, pero se carece aún de estudios sobre la cinética de esta interacción y de la posible modulación de la misma. Algunos estudios parecen indicar queStaphylococcus puede utilizar los materiales de catéteres intravenosos para multiplicarse en medios sin nutrientes convencionales. Este extremo parece en principio de gran interés y tampoco ha sido evaluado hasta la fecha en relación conPseudomonas aeruginosa. Otro de los aspectos que recientemente se están analizando en detalle es la acción que las concentraciones subinhibitorias de antimicrobianos ejercen sobre la adherencia de los microorganismos. Se han reconocido diversos mecanismos de acción para las concentraciones subinhibitorias: modificación de la forma bacteriana, inhibición de la síntesis de adhesinas, e inducción de la síntesis de adhesinas funcionalmente deficientes. Normalmente estas alteraciones producen una disminución de la adherencia; pero se conocen casos en que pueden aumentarla. La mayoría de estos estudios han sido realizados en la interacción bacteria-superficie celular, pero hay muy pocos referidos a la interacción con biopolímeros de uso médico. Una vez que se ha producido la colonización de una superficie, el tratamiento antibacteriano se hace mucho más problemático hasta el punto que en la mayoría de las situaciones se hace necesario eliminar el biomaterial quirúrgicamente para poder controlar la infección. Se ha comprobado que vancomicina no inhibe el crecimiento de cepas de Staphylococcus epidermidis, sensibles “in vitro”, cuando se encuentran en las biocapas formadas sobre una superficie sólida, ni a las bacterias de la fase líquida donde dicha superficie se halla sumergida; tanto las bacterias adheridas como las libres tienen valores de CMB altísimos, mucho mayores que cuando crecen en medios convencionales, pudiendo considerarse tolerantes a este antimicrobiano. También se ha comprobado que la tobramicina no posee acción bactericida sobrePseudomonas aeruginosa asociada a la biomateriales, esta acción no llega a conseguirse ni aun con el empleo de concentraciones 50 veces superiores a la CMB que tiene las bacterias libres en la fase líquida donde se encuentra sumergido el biomaterial; se desconoce si este mismo fenómeno tendrá lugar con otros antimicrobianos, pero de hecho, hasta ahora, carecemos de sustancias eficaces para la lucha antibacteriana en este tipo de situaciones. Los datos expuestos permiten aclarar situaciones clínicas en principio paradójicas: se sabe que con frecuencia la administración de un antimicrobiano activo in vitro no se sigue de la correspondiente y deseable mejoría del paciente: presumiblemente el antimicrobiano es activo frente a los microorganismos libres en fases líquidas pero no frente a aquellos que están colonizando una superficie del huésped. Cuando el tratamiento se suspende al cabo de un tiempo las biocapas de las zonas colonizadas permiten la liberación de nuevos microorganismos, lo que ocasiona una recaída en el proceso. Es evidente, por tanto, la necesidad de profundizar en los conocimientos de este tipo de interacciones a fin de lograr una lucha eficaz frente a las mismas. Teniendo en cuenta las consideraciones expuestas decidimos realizar este trabajo, con objeto de estudiar la adherencia dePseudomonas aeruginosa a distintos biomateriales y el efecto de los mismos en la viabilidad del microorganismo. Para ello hemos incluido cepas no mucoides y cepas mucoides estudiando su interacción con un polímero hidrófobo, el poliestireno, y con varios biopolímeros de uso médico: cloruro de polivinilo, poliuretano y látex siliconizado. Decidimos estudiar la importancia de la hidrofobicidad de superficie y la producción de “slime” en este proceso y cual era la acción moduladora que sobre el mismo ejercen concentraciones subinhibitorias de antimicrobianos. Para obtener información morfológica del proceso de adherencia se incluyó en el estudio la observación de los catéteres a los que se había adheridoPseudomonas aeruginosa con microscopía electrónica de barrido. Para todo ello establecimos los siguientes objetivos: 1.- Aislamiento, identificación y determinación de la sensibilidad a seis antimicrobianos (amicacina, ceftazidima, imipenema, ciprofloxacina, norfloxacina y ofloxacina) de seis cepas no mucoides y tres cepas mucoides dePseudomonas aeruginosa. Obtención de una variante no mucoide de una de las cepas mucoides. 2.- Determinación de la hidrofobicidad de superficie de las nueve cepas tras su crecimiento en reposo y en agitación. Valores de la hidrofobicidad de superficie de nuestras cepas en presencia de sulfato amónico. Variaciones de los valores de hidrofobicidad de superficie cuando las cepas fueron preincubadas en suero humano y en concentraciones subinhibitorias de los antimicrobianos considerados. 3.- Estudio de la producción de “slime” en nuestras cepas. 4.- Adherencia de cepas hidrófilas e hidrófobas a un polímero hidrófobo, poliestireno. Modulación de la misma por la preincubación en suero humano y por el pretratamiento bacteriano con concentraciones subinhibitorias de antimicrobianos. 5.- Estudio de la cinética de adherencia de nuestras cepas a tres biopolímeros (cloruro de polivinilo, poliuretano y látex siliconizado), empleando para ello catéteres intravasculares y peritoneales y sondas urinarias de uso habitual en el medio hospitalario. Cinética de la adherencia de una variante no mucoide procedente de una cepa mucoide a estos biomateriales. Adherencia comparativa a dos catéteres con igual polímero base (cloruro de polivinilo) de diferentes procedencia comercial. 6.- Modulación de la adherencia dePseudomonas aeruginosa por la preincubación bacteriana en concentraciones subinhibitorias de antimicrobianos. 7.- Estudio con técnicas de microscopía electrónica de barrio de las interacciones entrePseudomonas aeruginosa y los diferentes biomateriales considerados. 8.- Estudio del efecto que la presencia de biomateriales tiene en la viabilidad dePseudomonas aeruginosa en suspensión.