Tesis (Microbiología y Parasitología)
https://hdl.handle.net/11441/11058
2024-03-28T09:19:34ZDesarrollo y validación de métodos inmunológicos para la estimación del gluten consumido y sus aplicaciones en la enfermedad celiaca
https://hdl.handle.net/11441/155732
Desarrollo y validación de métodos inmunológicos para la estimación del gluten consumido y sus aplicaciones en la enfermedad celiaca
La enfermedad celiaca (EC), se define como una enteropatía inflamatoria crónica del intestino delgado causada por la ingesta de gluten en individuos genéticamente predispuestos. Por tanto, es el resultado de la interacción del gluten con factores inmunológicos, genéticos y ambientales. Afecta aproximadamente al 1,4% de la población, aunque su prevalencia puede variar en función de la edad, el continente y la región. Esta patología está infradiagnosticada a nivel mundial ya que los criterios utilizados en los diferentes estudios epidemiológicos para su diagnóstico no son uniformes, así por ejemplo el estudio serológico, en adultos, requiere confirmación histológica.
Las proteínas del gluten están presentes en el trigo, la cebada, el centeno la avena y sus derivados, y se degradan de forma deficiente en el tracto gastrointestinal ya que son resistentes a las enzimas digestivas. Tras la ingestión de alimentos con gluten se generan péptidos inmunogénicos que son capaces de producir daño en la mucosa intestinal con una lesión que se caracterizada histológicamente por infiltrado de linfocitos intraepiteliales e hiperplasia de las criptas con distintos grados de atrofia de las vellosidades intestinales, El cuadro clínico de la EC es heterogéneo, presenta una gran variedad de síntomas que pueden ser tanto gastrointestinales como extraintestinales, y que difieren considerablemente en función de la edad de presentación.
La actual forma recomendada para el diagnóstico de la EC se basa en un flujo de pruebas, donde las primeras suelen ser las serológicas. No obstante, estas pruebas de diagnóstico sólo son válidas para detectar la enfermedad en aquellas personas que consumen gluten de forma regular y sin restricción en su dieta. Una vez efectuado el diagnóstico, la única terapia disponible es la adhesión a una dieta sin gluten (DSG) de por vida. No obstante, la completa exclusión del gluten de la dieta es complejo y las transgresiones dietéticas, tanto voluntarias como involuntarias, son frecuentes. Por ello, una monitorización continua del paciente para asegurar una correcta adherencia a la DSG resulta necesaria. Para la monitorización clínica de esta patología las guías clínicas recomiendan que en la práctica clínica se realicen de forma periódica pruebas serológicas, estudios de la sintomatología, cuestionarios dietéticos y biopsias intestinales. Sin embargo, se ha demostrado que estas herramientas son poco eficientes, invasivas o inexactas para evaluar la adherencia a la DSG. Por lo que contar con herramientas fiables para la monitorización de la DSG de forma eficiente y no invasiva es vital. En los años 2012 y 2017 se publicaron unos estudios con los que se abría la posibilidad de utilizar la determinación de los péptidos inmunogénicos del gluten (GIP) en heces y orina, respectivamente, como marcadores directos de la ingesta de gluten, ya que permiten monitorizar la adherencia a la DSG en pacientes con EC. La recuperación de cantidades medibles de GIP en estas excreciones corporales indica de forma directa que el gluten ha pasado por el tracto digestivo y, que, por lo tanto, es al menos parcialmente resistente a la digestión gastrointestinal humana, además de que puede absorberse y acceder al torrente sanguíneo.
Estas herramientas de diagnóstico o seguimiento requieren para su amplia aplicación en la rutina clínica en la Unión Europea del marcado IVD (Diagnostico In Vitro) y CE (Conformidad Europea).
En este contexto, esta tesis doctoral se ha centrado en el desarrollo y validación de nuevas metodologías analíticas en ELISA e inmunoensayos de flujo lateral con soluciones alternativas para facilitar el diagnóstico de la EC y la detección de la ingesta de gluten, así como el alcance de sus aplicaciones.
El Capítulo 1 es una introducción general sobre los trastornos relacionados con el consumo de gluten, con especial atención a la EC, y sobre inmunoensayos para la detección del gluten y GIP detallando además los factores a tener en cuenta durante el desarrollo y la validación de los mismos.
En el Capítulo 2 se exponen los antecedentes del tema y los objetivos principales de esta Tesis Doctoral.
El Capítulo 3 incluye la validación del iVYCHECK GIP Urine, un IEFL de uso en el seguimiento de la DSG mediante la detección de los GIP para su conformidad con el reglamento 746/2017 con el objetivo de poder obtener el marcado CE IVD.
En el Capítulo 4 se demuestra la utilidad clínica en atención primaria del CeliacDetect, un IEFL para la detección de anti-tTG-IgA en sangre, para la detección precoz de la EC mediante cribado en población pediátrica, y explorar, la conveniencia de monitorizar el consumo de gluten reciente para hacer más eficaces dichos diagnósticos.
El Capítulo 5 describe el desarrollo de un método ELISA para la detección de GIP en orina y sus aplicaciones durante el diagnóstico y seguimiento de la EC.
Por último, en el Capítulo 6, contiene las conclusiones alcanzadas en esta Tesis Doctoral.
2023-12-04T00:00:00ZInhibición de la actividad ATPasa del complejo SWI/SNF: cambios cromatínicos y de la expresión génica
https://hdl.handle.net/11441/147910
Inhibición de la actividad ATPasa del complejo SWI/SNF: cambios cromatínicos y de la expresión génica
Los complejos SWI/SNF fueron la primera maquinaria de remodelación de cromatina
dependiente de ATP descubierta y están compuestos por 11-15 proteínas diferentes en
mamíferos. Su actividad enzimática la llevan a cabo dos ATPasas mutuamente
excluyentes, denominadas BRM (SMARCA2) y BRG1 (SMARCA4). Recientemente se
ha desarrollado una nueva molécula que inhibe la actividad de BRG1 y BRM,
denominada BRM014, y que, por lo tanto, inhibe a todos los complejos SWI/SNF.
Sorprendentemente, este inhibidor solo afecta la expresión de aproximadamente el 10%
de los genes expresados en la línea no cancerosa de epitelio mamario de ratón NMuMG.
Hemos investigado las características estructurales y transcripcionales, así como el
entorno cromatínico de los genes dependientes e independientes de SWI/SNF. Se ha
mostrado que la accesibilidad del 90% de los promotores de genes activos de la línea
NMuMG no se ve afectada tras el tratamiento con BRM014, mientras que
aproximadamente el 56% de otros elementos regulatorios distales en cis si cambian.
Describimos que en ausencia de la actividad SWI/SNF ocurre una fuerte ocupación
nucleosomal de elementos regulatorios con claras características de enhancers. En un
pequeño grupo de promotores la inhibición de SWI/SNF provoca un uso alternativo de
inicios de la transcripción y un aumento de la transcripción antisentido a partir de
promotores. Por otro lado, nuestros datos no muestran un defecto general en la
eficiencia de splicing en ausencia de de la actividad SWI/SNF. Finalmente, observamos
que, BRM014 afecta el nivel basal de expresión de genes relacionados con la transición
de epitelio a mesénquima (EMT) y las vías de transducción de señales RAS. Además,
BRM014 afecta fuertemente la inducción dependiente de TGFβ de la EMT, proceso
implicado en la formación de metástasis.
2023-06-12T00:00:00ZTaxonomía molecular y filogenia de especies de trichuris parásitas de hospedadores vertebrados
https://hdl.handle.net/11441/147880
Taxonomía molecular y filogenia de especies de trichuris parásitas de hospedadores vertebrados
El principal objetivo de la presente Tesis Doctoral ha sido llevar a cabo un estudio
taxonómico y filogenético de diferentes especies del género Trichuris parásitas de
distintos hospedadores, principalmente primates no humanos (PNH), junto con otros
hospedadores vertebrados, de diferentes parques zoológicos de España. Los resultados
obtenidos aportarán nuevos datos de este género para clarificar la taxonomía actual y las
relaciones filogenéticas de este grupo de parásitos y para su lucha y control.
El desarrollo de la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo en varias etapas:
1. Recogida de muestras: Para ello se recogieron muestras de heces de distintos
hospedadores de diferentes parques zoológicos de España: primates, camellos,
puercoespines, etc.
2. Estudio morfológico y biométrico clásico: Para llevar a cabo la determinación
taxonómica por procedimientos clásicos. Se realizó un estudio morfo-biométrico
inicial basándonos en los parámetros más característicos citados por distintos
autores de las poblaciones de Trichuris de adultos obtenidas.
3. Estudio mediante morfometría geométrica: Para analizar si es una herramienta útil
en la identificación y diferenciación de las diferentes especies de Trichuris
analizadas.
4. Estudio molecular: taxonómico y filogenético. El estudio molecular de las
distintas especies del género Trichuris se realizó en varias etapas: extracción de
ADN; amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de
diferentes marcadores moleculares; purificación del productor de PCR;
cuantificación del ADN; y secuenciación. Todo ello con el fin de estudiar
diferentes marcadores moleculares ribosómicos, mitocondriales y del genoma
mitocondrial completo de las distintas especies objeto de estudio. Una vez
obtenidas las secuencias se alinearon y analizaron filogenéticamente basándonos
en tres parámetros fundamentales:
- La variabilidad interespecífica de las secuencias
- La variabilidad interpoblacional
- La variabilidad intrapoblacional
5. Análisis mediante la técnica MALDI-TOF MS de un gran número de muestras
pertenecientes a distintas especies del género Trichuris procedentes de distintos
hospedadores vertebrados. Los resultados obtenidos nos permitieron crear una
base de datos interna con los espectros de referencia para cada una de las especies
analizadas, con el fin de identificarlas y clasificarlas.; The main objective of this Doctoral Thesis has been to carry out a taxonomic and
phylogenetic study of different parasites species of the genus Trichuris from different
hosts, mainly non-human primates (NHP), together with other vertebrate hosts from
different zoological gardens from Spain. The results obtained will provided new data on
this genus to clarify the current taxonomy and phylogenetic relationships of this parasite
group and for its fight and control.
The development of this Doctoral Thesis has been carried out in several stages:
1. Collection of samples: For this purpose, stool samples were collected from
different hosts form different zoological gardens from Spain: primates, camels,
porcupines, etc.
2. Classic morphological and biometric study: To carry out the taxonomic
determination by classical procedures. An initial morpho-biometric study was
carried out of the adult Trichuris population obtained based on the most
characteristic parameters cited by different authors.
3. Study using geometrical morphometrics: To analyze if it is a useful tool in the
identification and differentiation of the different species of Trichuris analyzed.
4. Molecular study: taxonomic and phylogenetic. The molecular study of the
different species of the genus Trichuris was carried out in several stages: DNA
extraction; amplification of different molecular markers by polymerase chain
reaction (PCR); purification of the PCR product; DNA quantification; and
sequencing. All this in order to study different ribosomal and mitochondrial
molecular markers and the complete mitochondrial genome of the different
species under study. Once the sequences were obtained, they were aligned and
phylogenetically analyzed based on three fundamental parameters:
- The interspecific variability of the sequences
- Interpopulation variability
- Intrapopulation variability
5. Analysis using the MALDI-TOF MS technique of many samples belonging to
different species of the genus Trichuris from different vertebrate hosts. The results
obtained allowed us to create an internal database with the reference spectra for
each species analyzed, in order to identify and classify them.
2023-06-16T00:00:00ZDiseño de consorcios bacterianos potenciadores de la nodulación para la recuperación de estuarios degradados por estreses abióticos utilizando Medicago sativa
https://hdl.handle.net/11441/147726
Diseño de consorcios bacterianos potenciadores de la nodulación para la recuperación de estuarios degradados por estreses abióticos utilizando Medicago sativa
El deterioro de los suelos es uno de los problemas más acuciantes en la actualidad. Distintos tipos de estrés abiótico están presentes en suelos agrícolas y estuarinos que antes eran idóneos para cultivos y presentaban una gran biodiversidad. El manejo inadecuado de fertilizantes químicos, la salinidad, los metales pesados y otros contaminantes han contribuido a la pérdida de nutrientes y microorganismos que aportan beneficios a los suelos. En Huelva (Andalucía, España) se encuentran estuarios con gran importancia ecológica y económica, como el conjunto de estuarios de los ríos Tinto y Odiel, muy estudiados por ser una de las regiones con mayor contaminación por metales pesados del mundo, y el estuario del río Piedras, con zonas descritas como suelos pobres en nutrientes.
Para poder contrarrestar el daño causado por estos estreses abióticos se han propuesto alternativas biotecnológicas de biorremediación, más sostenibles con el medio ambiente y más económicas que los tratamientos de remediación físico-químicos convencionales. En este sentido, las leguminosas son una excelente opción para recuperar suelos degradados que se encuentran expuestos a estrés abiótico, a través de la fijación biológica de nitrógeno. Estas plantas son idóneas para la fitoestabilización de metales pesados, y las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB, Plant Growth Promoting Bacteria) se pueden utilizar como inoculantes para mejorar el crecimiento, la nodulación y, en definitiva, la adaptación de las leguminosas a los suelos contaminados.
Las medidas de minerales y macronutrientes realizadas en las marismas del río Piedras mostraron una deficiencia nutricional y un bajo contenido de materia orgánica, convirtiéndolo en un suelo degradado medioambientalmente. Por otro lado, la concentración de metales/loides presentes en los suelos del estuario del río Odiel sobrepasaron los valores permitidos por la legislación autonómica y estatal en parques naturales, suelos agrícolas e industriales.
En esta Tesis Doctoral se propone la utilización de microorganismos autóctonos, incluyendo bacterias rizosféricas, endófitas no rizobios asociadas al nódulo y rizobios, con propiedades que promueven el crecimiento de la planta (PGP) para mejorar el crecimiento y la adaptación de plantas de Medicago sativa, así como incrementar su capacidad de fitoestabilizar metales, para la recuperación de los suelos estuarinos degradados y/o contaminados. Se aislaron rizobacterias y bacterias endófitas cultivables de nódulos de plantas de Medicago spp. que crecen en las marismas de los ríos Piedras y Odiel, respectivamente. La selección de las bacterias para realizar experimentos in vitro y en condiciones de invernadero se realizó en base a sus propiedades PGP como las auxinas, ACC desaminasa y la formación de biofilm entre otras, la presencia de enzimas líticas, entre ellas la quitinasa, pectinasa y amilasa entre otras, y la resistencia a metales pesados. Las bacterias endófitas seleccionadas fueron dos Pseudomonas (Pseudomonas sp. N4 y Pseudomonas sp. N8) y dos rizobios (Ensifer sp. N10 y Ensifer sp. N12) y tres rizobacterias (Pseudomonas sp. L1, Chryseobacterium soli L2 y Priestia megaterium L3). También se seleccionaron tres bacterias de colección por sus propiedades PGP y la resistencia a metales. Estas últimas incluyen Ensifer medicae MA11, un rizobio que nodula Medicago spp., y dos endófitos del género Variovorax (V. paradoxus S110T y V. gossypii JM-310T). Se emplearon inoculantes individuales, combinaciones rizobacterias-rizobios o rizobios-endófitos, y se diseñaron tres consorcios bacterianos compuestos por tres rizobacterias (Pseudomonas sp. L1, Chryseobacterium soli L2 y Priestia megaterium L3) y un rizobio (Ensifer medicae MA11; CSL), el mismo rizobio (Ensifer medicae
MA11) y los dos endófitos del género Variovorax (V. paradoxus S110T y V. gossypii JM-310T; CSV) y, por último, un consorcio compuesto por dos endófitos no rizobios (Pseudomonas sp. N4 y Pseudomonas sp. N8) y dos rizobios autóctonos (Ensifer sp. N10 y Ensifer sp. N12; CSN).
Estas inoculaciones mejoraron la germinación, la nodulación y el crecimiento de las plantas en experimentos in vitro. En condiciones de invernadero con suelos de los estuarios mejoraron la nodulación, el estado fisiológico de la planta, los parámetros fotosintéticos, el contenido de clorofila y nitrógeno, la respuesta al estrés de la planta, además de mejorar la acumulación de metales en las raíces M. sativa en suelos degradados con niveles de moderados a altos de contaminación.
Partiendo de la mencionada propuesta, en esta Tesis Doctoral se ha demostrado que las inoculaciones de M. sativa con los consorcios bacterianos compuestos por rizobios y endófitos resistentes a metales o rizobacterias con propiedades PGP son herramientas útiles para la fitoestabilización de metales/oides y para promover el crecimiento de leguminosas en suelos con distintos tipos de estrés abiótico, contribuyendo a la recuperación de estos ecosistemas. Con esta estrategia se garantiza, además, una mínima translocación de metales a la parte aérea de las plantas, por lo que podrían utilizarse, además de en estrategias de fitoestabilización de metales, como plantas forrajeras.
2023-05-18T00:00:00Z