Tesis (Bioquímica Vegetal y Biología Molecular)

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Acción de reguladores de la diferenciación en el establecimiento del patrón de heterocistos en la cianobacteria anabaena SP. PCC 7120
(2014-07-03) Corrales Guerrero, Laura; Flores García, Enrique; Herrero Moreno, Antonia; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Anabaena sp. PCC 7120 es una cianobacteria multicelular capaz de producir dos tipos celulares diferentes cuando el ambiente lo propicia. En condiciones de bajo nivel de nitrógeno combinado, algunas células se diferencian a heterocistos, que están especializados en la fijación del nitrógeno molecular. Esta diferenciación sigue un patrón definido por el cual sólo una de cada 10 células se diferencia, lo cual requiere una regulación compleja en la que están involucradas más de 30 proteínas reguladoras. En esta tesis se han estudiado 6 de ellas, intentando obtener una visión global de sus relaciones durante el proceso de diferenciación. La proteína HetR está considerada el principal regulador de la diferenciación, siendo un factor de transcripción que se pensaba funcionaba en los primeros momentos del proceso. Aquí hemos demostrado que la proteína HetR ejerce su regulación desde antes de que el ambiente cambie. También se han estudiado los reguladores negativos del proceso, PatS y HetN. Se ha demostrado la función de cada aminoácido del péptido PatS, así como su procesamiento y posterior exporte y la concreta localización de HetN en los polos de los heterocistos. Por otro lado, se ha estudiado la proteína HetC, que ejerce un papel positivo en el desarrollo de los heterocistos y su relación con sus vecinos genómicos, HetP y Asr2819, también relacionados positivamente con la diferenciación de los heterocistos.
La adaptación a la deficiencia de zinc en cianobacterias. Papel de treonil-trna sintetasas duplicadas
(2016-03-07) Rubio Gómez, Miguel Ángel; Luque Romero, Ignacio; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Las aminoacil tRNA sintetasas (aaRSs) son las enzimas que catalizan la carga del aminoácido en el tRNA y son las responsables de mantener la fidelidad en la traducción del código genético. Las aaRSs son componentes esenciales de la síntesis proteica y son ubicuas en todos los dominios de la vida (Ibba y Sol, 2000; Perona y Hadd, 2012). La cianobacteria filamentosa Anabaena sp.PCC 7120 contiene dos genes de treonil tRNA sintetasa, alr0335(thrS1) y all4723 (thrS2), originados por un evento de duplicación génica ocurrido en el phylum (Luque et al., 2008). Si bien ambos genes cifran ThrRSs bioquímicamente activas, su patrón de regulación es muy diferente: mientras que thrS1 se expresa constitutivamente en condiciones estándar de cultivo, thrS2 solo se induce tras la adición de TPEN –un quelante de iones divalentes-al cultivo (Napolitano et al., 2012). En esta tesis se ha identificado el regulador que reprime la expresión del gen thrS2, el regulador Zur, que permite la expresión en condiciones de deficiencia de zinc. Se han analizado el conjunto de genes que se encuentra bajo la acción de este regulador (regulón), entre los que se encuentras transportadores de la membrana externa e interna y homólogos que utilizan cofactores alternativos al zinc, lo que ha permitido delinear la estrategia de adaptación de Anabaena a la carencia de dicho metal. Se ha caracterizado asimismo el sistema compuesto por las dos treonil-tRNA sintetasas, T1 y T2. La enzima T1 es la encargada de aminoacilar el tRNA en condiciones estándar, mientras que esta actividad es llevaba a cabo por T2 en condiciones de bajo zinc. Sorprentemente, ambas proteínas utilizan exclusivamente zinc como cofactor, por el que poseen una afinidad similar. Aunque ambas son proteínas diméricas, la pérdida del cofactor metálico induce la monomerización de T1, pero no de T2. La enzima T2 es defectiva en la edición y produce tRNA cargado con el aminoácido ilegítimo serina a una elevada tasa. Ambas enzimas pueden formar heterodímeros T1-T2, que trabajan de forma concertada durante la aclimatación a la deficiencia de zinc, siendo T2 la enzima encargada de la aminoacilación y T1 responsable de editar el tRNA cargado con serina. El ensanblaje de oligómeros de T1 y T2 está controlado por la célula y se adapta a las necesidades fisiológicas de ésta (en este caso, la deficiencia de zinc). Hemos detectado más de 26000 genomas que contienen genes de aaRSs duplicados, por lo que se propone que la oligomerización controlada de subunidades puede ser un mecanismo general para generar variabilidad que exceda a aquella contenida en el repertorio genético.
Aislamiento y caracterización bioquímica de mutantes de Chlamydomonas reinhardi afectados en su capacidad de asimilar nitrato
(1976-11) Sosa Suárez, Francisco Manuel; Cárdenas, Jacobo; López Barea, Juan; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Alternative photosynthetic redox proteins in the diatom Phaeodactylum tricornutum
(2021-09-17) Castell Capitán, María Carmen; Hervás Morón, Manuel; Navarro Carruesco, José Antonio; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
La fotosíntesis es la principal vía de entrada de energía en la biosfera y la ruta más importante de fijación y secuestro de dióxido de carbono. Aproximadamente la mitad de la productividad fotosintética ocurre en los océanos. Sin embargo, en estos ecosistemas nos encontramos grandes áreas pobres en fitoplancton debido a una limitación delhierro disponible como nutriente. Las algas diatomeas,microalgas eucariotas unicelulares fotosintéticas,son constituyentes fundamentales del fitoplancton oceánico, contribuyendoaproximadamente al 40 % de la fijación de carbono global marina, por lo que pueden ser consideradas así las mayores productorasprimariasen los océanos. Además,las diatomeastienen usos biotecnológicos relevantes. La limitación por hierro en el crecimiento de las diatomeas fue demostrada tras experimentos de fertilización masiva con hierroen el océano, donde, tras dicha fertilización, se produjeron explosiones de biomasaen las que predominabanlasdiatomeas. Phaeodactylum tricornutum(P. tricornutum),en la que se centra este trabajo de tesis, es una de las diatomeas modelos más usadas en investigación, debido tanto a su pequeño genoma (27,4 megabases), a su corto tiempo de crecimiento, a la facilidad de su cultivoy a las diferentes técnicas genéticasque se pueden emplear para su manipulación. Las diatomeas presentan un requerimiento extra de hierro en su cadena fotosintética, primero porque poseen citocromo c550(Cc550) asociado al fotosistema II (PSII), proteína ausente en algas verdes y plantas. Además, la mayoría de las diatomeas carecen de plastocianina (Pc) como alternativa al citocromo c6(Cc6) como transportador de electrones entre el citocromo f (Cf), del complejo b6f(Cb6f),y el fotosistema I (PSI). Una excepción a esto último es la diatomea Thalassiosira oceanica(T. oceanica), en la que se han encontrado evidencias de la presencia de una Pc “roja”. Por todo ello, en esta tesis se han establecido varios objetivos, enfocados al estudio de estas proteínas redox alternativas en fotosíntesis: i) caracterización del Cc550de la diatomea P. tricornutumy los efectos de la falta de hierro en su función como subunidad extrínseca del PSII; ii) efectos de la expresión heteróloga de la Pc del alga verdeChlamydomonas reinhardtii(C. reinhardtii) en P. tricornutum; iii) modelado del complejo de transferencia electrónica [Cf:aceptor] en las diatomeas P. tricornutumy T. oceanica. Nuestros resultados, respecto al Cc550de P. tricornutum, muestran que dicha proteína es purificada en una forma truncada, careciendo de las dos últimas tirosinas, cuando se purifica siguiendo protocolos estándares de purificación. Sin embargo, se ha demostrado, a través de un nuevo protocolo diseñado para purificar el Cc550completo, que el truncamiento es un proceso no fisiológico. Además, la limitación por hierro en los cultivos de esta diatomea induce una drástica bajada en el contenido tanto del Cc550como dela actividad delPSII. Por otro lado, se ha comprobado quela correcta expresión heteróloga de la Pc de C. reinhardtiien P. tricornutumincrementa el crecimiento de esta diatomea en condiciones de deficiencia de hierro. Estos mutantes presentan una mejora en las actividades tanto del PSI como del PSII. Por último, hemos podido ver que el mejor modelo de docking del complejo [Cf:Cc6] de P. tricornutumtiene una orientación diferente al mismocomplejo en C. reinhardtii, siendo más similaral descrito previamente en cianobacterias. Los modelos de docking del complejo [Cf:Pc] de la diatomea T. oceanicamuestran que el complejo no está optimizado para una sola configuración, lo quepodríaindicarque aún no se ha alcanzado una configuración optima para la transferencia de electrones. Además, las configuraciones de energía más favorablede este complejo corresponden a orientaciones aparentemente no productivas, pero que podrían constituiruna posible vía alternativa de transferencia de electrones del Cf a la P.
Análisis de factores genéticos en enfermedades relacionadas con los estrógenos
(2008-02-11) Morón Civanto, Francisco Jesús; Ruiz Laza, Agustín; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Análisis de los factores de HLA de clase II que confieren susceptibilidad a la artritis reumatoide en una población española
(1993-05-28) Yélamos López, José; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular; Sánchez Sánchez, Berta
Análisis de metabolitos de Haematococcus pluvialis en cultivo continuo durante la acumulación de astaxantina
(2019-07-11) Hoys Hernández, Cristina; García González, Mercedes; Río Sánchez, Esperanza del; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
El trabajo que se recoge en esta tesis se ha realizado en el laboratorio del grupo “Biotecnología de Microalgas” del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (CicCartuja). El objetivo central ha sido conocer el perfil bioquímico de células de Haematococcus pluvialis en cultivo continuo bajo la influencia de un ciclo solar simulado en condiciones de biosíntesis de astaxantina y, a través de su comparación con las células que no sintetizaban astaxantina, derivar una información válida que permitiera conocer la situación metabólica de las células cuando se producía la activación de la síntesis del pigmento. El estudio metabolómico se ha realizado en dos momentos concretos del ciclo solar, a mitad del inicio del periodo de iluminación y oscuridad. El establecimiento de una adecuada combinación de las condiciones de cultivo en régimen continuo, ha permitido mantener células en crecimiento activo en las que el proceso de síntesis de astaxantina se estaba iniciando, situación adecuada para abordar estudios metabólicos. Asimismo, la optimización de la técnica de cromatografía de gases-masas que se ha utilizado para determinación de ácidos orgánicos y azúcares, ha constituido buena parte de este trabajo, permitiendo detectar estos compuestos con un alto nivel de sensibilidad combinando los métodos de detección full scan y SIM. Los resultados más significativos del estudio metabólico comparativo entre células que acumulaban astaxantina y las que no lo hacían durante el periodo de iluminación mostraba que, en condiciones de acumulación, se incrementaba el contenido en astaxantina, ácido oleico, citrato, glucosa, fructosa y sacarosa. Durante el periodo de oscuridad, el comportamiento era opuesto respecto a glucosa y fructosa que disminuían su contenido posiblemente porque se estaban utilizando como sustratos respiratorios. Además se incrementaba levemente el contenido de α-cetoglutarato. En conjunto, estas modificaciones estarían relacionadas con la acumulación del pigmento que requiere ácido oleico para su esterificación, azúcares como fuente de energía y/o poder reductor para la síntesis y citrato que podría estar siendo utilizado como lanzadera de Acetil CoA hacia el citoplasma, para promover la síntesis de ácidos grasos (susceptibles de ser esterificados con astaxantina) y de carotenoides mediante su conversión previa a piruvato. Este trabajo ha permitido identificar cambios en metabolitos en condiciones de síntesis de astaxantina frente a una situación de no acumulación, constituyendo una aportación al conocimiento del mapa metabólico asociado a la síntesis de astaxantina en poblaciones de Haematococcus pluvialis morfológicamente homogéneas generadas en cultivo continuo. Esta información podría resultar de interés a la hora de diseñar posibles actuaciones de ingeniería metabólica, en la que la identificación previa de los compuestos implicados y las relaciones que se establecen entre ellos es de gran relevancia. La reciente publicación del genoma secuenciado de Haematococcus pluvialis (Luo Q. 2019), ofrece la posibilidad de generar mutantes en enzimas relacionadas con la síntesis de estos metabolitos que potencien su efecto, lo que podría incrementar la producción de astaxantina.
Análisis Estructural de los Determinantes de la Estabilidad en Plastocianinas
(2011) Muñoz López, Francisco Jesús; Díaz Quintana, Antonio Jesús; Rosa Acosta, Miguel Ángel de la; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
La vida se encuentra en casi cualquier lugar de la Tierra, tanto en las grietas hidrotermales de los suelos marinos o en las aguas en ebullición de los géiseres, como en los picos de la cordillera del Himalaya o en las frías extensiones de la Antártida. Los seres vivos se pueden clasificar en función del ambiente en el que habitan y de su adaptación al mismo. Así encontramos organismos psicrófilos o termófilos, adaptados a bajas o altas temperaturas respectivamente; halófilos, en ambientes con una alta concentración salina; acidófilos o alcalífilos propios de ambientes de bajos o altos pH respectivamente; los barófilos en condiciones de alta presión, etcétera. En general, estos organismos se denominan extremófilos y han llamado la atención de numerosos científicos desde los primeros estudios llevados a cabo por Perutz y colaboradores en los años 70 (Perutz y Raidt, 1975; Perutz, 1978). Según la temperatura óptima de crecimiento (TOC), los organismos se clasifican en cuatro grupos: psicrófilos, con una TOC en el rango de -5 a 15 ÂºC, mesófilos con una TOC entre 15 y 45 ÂºC, termófilos con una TOC entre 45 y 80 ÂºC, y los hipertermófilos (o termófilos extremos) con una TOC superior a 80 ÂºC (Vieille y Zeikis, 2001; Li et al., 2005). Las proteínas originarias de organismos mesófilos se denominan proteínas mesofílicas, y termofílicas las de los organismos termófilos o hipertermófilos (Pantazaki et al., 2008). Desde el punto de vista de la biología celular, los componentes de la membrana y pequeñas moléculas protectoras juegan un papel importante en el caso de las adaptaciones a salinidad, pH o presión extremas, (Jaenicke, 1991; Yancey et al., 1982; van de Vossenberg et al., 1998). En las adaptaciones a temperaturas extremas, los componentes celulares como por ejemplo, las proteínas, deben ser termoestables (Jaenicke y Zavodszky, 1990).
Análisis genético y molecular de la reducción de nitrato a nitrito en la cianobacteria Synechococcus SP. PCC 7942
(1999) Rubio Herrero, Luis Manuel; Flores García, Enrique; Herrero Moreno, Antonia; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
En este trabajo se han estudiado diversos aspectos de la proteinanitrato reductasa asimilatoria y de la genética de la reducción del nitrato a nitrito en Synechooocus sp.PCC 7942, OBTENIENDOSE LAS las siguientes conclusiones. 1. Se han identificado todo
Análisis in vivo del metabolismo liposintético en semillas de girasol (Helianthus annus L.)
(2005-04-22) Pleite Gutiérrez, Rafael; Garcés Mancheño, Rafael; Martínez Force, Enrique; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Se cree que el girasol (Helianthus annus L.) tiene su origen en el suroeste de Norte América y que domesticado originariamente en el área centro-oeste del actual EEUU hacia el año 5000 a.d.C. El cultivo se introdujo en Europa en el siglo XVI inicialmente como una planta ornamental y más tarde se desarrolló para alimento y usos medicinales, siendo en Rusia a lo largo del siglo XIX donde comenzó a ser usado como cultivo oleaginoso (Fick, 1989). Debido a sus elevados contenidos en aceite y proteínas, las semillas oleaginosas constituyen uno de los principales cultivos de la agricultura mundial. El cultivo de girasol, con más de 9 millones de Tm de aceite producido anualmente, ocupa el cuarto lugar a nivel mundial detrás de la soja, palma y colza. En Europa, debido a razones climatológicas y socioeconómicas ocupa el segundo lugar por detrás del cultivo de colza, situándose la producción del pasado año 2003 en 4,8 millones de Tm. España, con una producción media anual de 480.000 Tm de aceite en los últimos 10 años, se encuentra entre los principales productores mundiales de aceite de girasol, siendo sólo superada por Francia, Argentina y por los países miembros de la extinta URSS: Ucrania y la Federación Rusa. (FAOSTAT 2003). La incubación de semillas de girasol en desarrollo con [14C]acetato y el posterior análisis de la radioactividad incorporada a los ácidos grasos de la fracción de TAG reflejan la síntesis in vivo de ácidos grasos, principalmente síntesis intraplastidial, y además permite diferenciar entre distintos genotipos afectados en distinta actividades enzimáticas responsables de la síntesis de novo de ácidos grasos. La incubación de semillas de girasol en desarrollo con [14C]acetato y metil viológeno reduce el marcaje de ácido oleico e incrementa el de ácido esteárico de los ácidos grasos sintetizados de novo que se incorpora a la fracción de triacilglicéridos del aceite de las semillas. En líneas de girasol alto-olieco, el índice de saturación para 10 mM de metil viológeno indica las potencialidades existentes en el genoma de la planta por incrementar el contenido de ácido esteárico de los segregantes fruto del cruce con plantas mutantes alto esteáricos CAS-3. La actividad KAS II presente en semillas de girasol en desarrollo podría utilizar un exceso de 18:0-ACP como substrato para producir 20:0-ACP en el interior del plastidio. Se ha puesto de manifiesto la existencia de un ritmo biológico en el metabolismo lipisintético de semillas de girasol en desarrollo, este ritmo es reproducible en distintas condiciones ambientales. Las variaciones periódicas observadas en la composición de ácidos grasos marcados dentro de la fracción de TAG, sugieren la existencia de variaciones cualitativas en la maquinaria enzimática responsable de la síntesis intraplastidial de ácidos grasos, junto con las oscilaciones en el flujo de carbono que legan a las semillas, durante los ciclos luz/oscuridad. Esta hipótesis se ve apoyada por las fluctuaciones rítmicas medidas en la actividad enzimática estearil-ACP desaturasa. Los plastidios aislados de semillas de girasol en desarrollo de 17 y 24 DDF no incorporan [1-14C]glucose 6-phosphate (Glc6P) dentro de la fracción de ácidos grasos. El malato, cuando se les suministra sólo es, el responsable de las mayores tasas de síntesis de ácidos grasos para ambas edades. El piruvato es responsable de unas tasas de síntesis de ácidos grasos comparables a las obtenidas con mulato, pero solo cuando es incubado junto con Glc6P. El efecto estimulador que tiene la Glc6P sobre la utilización de piruvato como fuente de carbono para la síntesis de ácidos grasos en plastidios de 17 DDF, se relaciona con la rápida utilización de Glc6P a través de la ruta oxidativa de las pentosas fosfato a esta edad. Nuestras observaciones realizadas sobre la tasa de utilización de los distintos metabolitos para la síntesis intraplastidial de ácidos grasos y el flujo de carbonos a través de la OPPP, son consistentes con la regulación redox de la OPPP a partir de la actividad plastidial glucosa-6-fosfato deshidrogenasa debida a la demanda de poder reductor en forma de NADPH. Se ha clonado parcialmente el mRNA que codifica al transportador de Glc6P presente en la membrana de plastidios de semillas de girasol en desarrollo.
Aportaciones al conocimiento del proceso de abscisión de la aceituna
(1980) Vioque Cubero, Blanca; Vioque Pizarro, Agustín; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
La gran importancia económica que el olivar tiene... En el momento de iniciar nuestros estudios, en el caso del olivar estaba sin resolver, limitándose los ensayos totalmente empíricos, a tratamientos de los árboles con diversas sustancias con el fin de provocar la caída de los frutos, sin afectar perniciosamente al resto del árbol y por ende, a sus posteriores cosechas. No cabe duda de que poder conseguir controlar la caída o abscisión de los frutos, retardándola o acelerándola según convenga, sería de la mayor importancia para su recolección, tanto manual como mecánica.|
Aproximación genético-bioquímica al estudio de la asimilación de nitrato en la cianobacteria "Anacystis nidulans R2"
(1987) Madueño Albi, Francisco; García Guerrero, Miguel; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Tras mutagénesis con transposón se han aislado 19 estirpes de la Cianobacteria Anacystis nidulans R2 incapaces de crecer en medio con nitrato como única fuente de nitrógeno. Se distinguen tres diferentes fenotipos en relación a la a ... ctividad de las enzimas implicadas en la reducción del nitrato. La estirpe FM16 muestra tanto actividad nitrato reductasa como actividad nitrito reductasa FM2 carece de la actividad nitrito reductasa y las restantes 16 estirpes carecen de la actividad nitrato reductasa. Con la excepción de FM2 que requiere amonio para crecer todas las demás estirpes mutantes crecen en medios con nitrito o amonio como únicas fuentes de nitrógeno. Los resultados de ensayos de transformación con plásmidos que contienen genes implicados en la asimilación de nitrato han permitido la clasificación de las 16 estirpes carentes de nitrato reductasa en tres grupos diferentes que corresponden a tipos previamente descritos. Estudios de los niveles de actividad nitrato reductasa en medios conteniendo diferentes fuentes de nitrógeno mostraron que a diferencia de lo que ocurre en la estirpe silvestre en las estirpes FM2 y FM16 la síntesis de nitrato reductasa es constitutiva encontrándose niveles significativos de enzima en células cultivadas en amonio. Por tanto FM2 representa un nuevo tipo de estirpe mutante afectada en asimilación de nitrato careciendo de nitrito reductasa y mostrando una regulación alterada del sistema de asimilación de nitrato. Por otra parte FM16 es otro mutante original que parece hallarse afectado a nivel de la entrada del nitrato en la célula así como desrregulado respecto a la represión por amonio de la síntesis de nitrato reductasa. Algunas de las estirpes mutantes se han utilizado en estudios encaminados a la caracterización del consumo de nitrato en Anacystis nidulans. Se ha obtenido información relevante concer|
Aproximación inmunológica y molecular a la estructura cuaternaria y regulación en cultivos sincrónicos de la ferredoxina-nitrito reductasa de chlamydomonas reinhardtii
(1993-09-22) Pajuelo Domínguez, Eloísa; Márquez Cabeza, Antonio José; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
En este trabajo hemos pretendido estudiar tres aspectos a nuestro juicio críticamente importantes en relación con la Fd-NiR de Chlamydomonas reinhardtii.1. Por una parte, hemos intentado esclarecer la estructura cuaternaria de la enzima, teniendo en cuenta la controversia que se ha generado en torno a la composición en subunidades de esta proteína. Este estudio lo hemos llevado a cabo basándonos f undamentalmente en una aproximación inmunoquímica.2. Por otra parte, hemos estudiado la regulación que presenta la Fd-niR en cultivos de Chlamydomonas reinhardtii sometidos a ciclos 12L:12D, y la relación de su comportamiento con el ciclo celular de alga, combinando los estudios inmunoquímicos a nivel de proteína con los de la actividad enzimática. 3. Finalmente, dado que hasta la fecha se carece de información acerca de la biología molecular de esta enzima en algas en general, y en Chlamydomonas reinhardtii en particular, hemos iniciado la aproximación de biología molecular, mostrándose los resultados logrados hasta la fecha.La ferredoxina-nitrito reductasa (Fd-NiR) de Chlamydomonas reinhardtii es una proteína monomérica de 63 kda. La enzima puede sufrir rotura proteolítica en dos fragmentos de 40 y 25 kda, el primero de los cuales retiene el dominio de interacción con la Fd. La cadena de 63 kda presenta reacción cruzada en inmunoblot con la Fd-Glutamato sintasa de Chlamydomonas reinhardtii, así como con las Fd-NiRs de otras algas verdes y, en menor grado, con las Fd-NiRs de plantas y cianobacterias. La fluctuación diaria de la Fd-NiR en cultivos sincrónicos de Chlamydomonas reinhardtii se debe a la síntesis/degradación de la proteína. La síntesis está asociada a los periodos de crecimiento celular y no parece estar sometida al control de un ritmo circadiano. Esta síntesis se produce en respuesta a la ausencia de NH4+ y a la disponibilidad de esqueletos carbonados, con independencia de la luz. Usando el CDNA de la Fd-NiR de espinaca hemos aislado un clon genómico de Chlamydomonas reinhardtii que hibrida a un APNM de 0.9 kb relacionado con el metabolismo del N.
Aproximaciones biotecnológicas para la producción de biocombustibles y otros productos químicos de valor
(2017-07-20) Hidalgo García, María Victoria; Puerta Fernández, Elena; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
La humanidad se ha valido históricamente de diferentes microorganismos fermentativos para la modificación de distintos tipos de alimentos y bebidas. Sin embargo, los microorganismos fermentativos no solo se han utilizado para estos fines, sino, además, para la generación de otros compuestos de valor, como es el caso del butano!. La producción fermentativa de butano!, mediante el uso de clostridios solventogénicos, fue de gran importancia durante la primera mitad del siglo XX, tanto para la industria armamentística en la producción de munición, como para la industria automovilística en la producción de lacas. Sin embargo, la producción fermentativa de este compuesto acabó siendo sustituida por la síntesis petroquímica que ofrecía unos menores costes de producción. Desde finales del siglo XX se ha experimento una creciente concienciación social respecto a los problemas medioambientales, especialmente a los relacionados con el cambio climático. Una de las principales fuentes de contaminación atmosférica es debida al uso de combustibles fósiles. Por este motivo, se han buscado alternativas más sostenibles y menos contaminantes que éstos, tales como los biocombustibles. A pesar de que el bioetanol es el biocombustible más utilizado en la actualidad, el butanol presenta unas propiedades físico-químicas superiores como su mayor contenido energético. Para que se pueda volver a retomar la producción industrial fermentativa del butanol sería imprescindible aumentar la producción de este compuesto. Para conseguir esta meta sería necesario tanto la optimización de los procesos, como la búsqueda de sustratos fermentativos baratos o de desecho, así como la mejora genética de las cepas productoras de esta sustancia. Los clostridios solventogénicos son microorganismos que muestran dos fases metabólicas. Una primera fase, llamada acidogénica, durante la que se produce el crecimiento exponencial, así como la producción de los ácidos acético y butírico, fundamentalmente, y una segunda fase, denominada solventogénica, en la que se producen los disolventes acetona, butanol y etanol, en parte gracias a la re-asimilación de los ácidos previamente generados, así como la producción de esporas. La reasimilación de los ácidos a disolventes es, en parte, un mecanismo para reducir la toxicidad de los primeros, sin embargo, los disolventes y en especial el butanol, son compuestos altamente tóxicos para las células, por lo que la generación de esporas supondría en parte un mecanismo de supervivencia frente a estos compuestos. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue la generación de cepas mutantes de C/ostridrium beijerinckii NCIMB 8052 y C. beijerinckii BA 101, que mostrasen una mayor producción de butanol que sus respectivas cepas parentales. Se decidió llevar a cabo una mutagénesis química al azar principalmente porque los mutantes obtenidos mediante esta técnica no son considerados como organismos genéticamente modificados, de acuerdo a la legislación europea, lo que puede facilitar su uso a nivel industrial. En primer lugar, se optimizaron las condiciones de la mutagénesis con el agente etilante EMS y se probaron tres estrategias de cribado indirectas para encontrar mutantes con una capacidad de producción de butanol superior. La estrategia más eficiente fue la utilización de placas de TYA con púrpura de bromocresol para detectar mutantes con una menor producción de ácidos, lo que en ocasiones puede correlacionarse con una mayor producción de disolventes, entre los que se encuentra el butanol. De entre todos los mutantes analizados se seleccionaron dos que mostraban una producción de butanol más elevada que sus respectivas cepas parentales, C. beijerinckii BP25 derivado de la cepa C. beijerinckii BA 101 y C. beijerinckii 8052.11 generado a partir de C. beijerinckii NCIMB 8052. Para evaluar la producción de butanol de estas cepas mutantes, se realizaron cultivos en medio TY A, por un lado, a escala de botella y por otro en fermentadores de un litro. En los cultivos en botella en medio TYA se comprobó que mientras que la cepa C. beijerinckii NCIMB 8052 no producía butanol, como consecuencia de una excesiva acidificación del medio, su mutante 8052.11 era capaz de producirlo. Por su parte, el mutante BP25, generado a partir de C. beijerinckii BA 101, mostró una tendencia a una mayor producción de butanol que su cepa parental. En lo que respecta a los cultivos en fermentador con control de pH a 5,5, se comprobó que la cepa silvestre NCIMB 8052 era capaz de producir butanol, si bien su cepa mutante 8052.11 producía un mayor título de este compuesto. La cepa BP25 también mostraba una producción de butanol superior que su cepa parental BA101. También se variaron distintos parámetros de cultivo a nivel de botella. Se observó cómo el aumento de la presión en el espacio de cúpula de la botella, debido a los gases generados durante la fermentación, podía tener efectos negativos sobre la producción e butanol. Asimismo, se vio que los cultivos realizados a 34ºC en lugar de a 37ºC, a pesar de mostrar una productividad más baja, alcanzaban una mayor producción final de butanol. Por último, se observó que al realizar los cultivos en agitación se incrementaba la productividad, alcanzándose la concentración máxima de butanol en el medio en un menor tiempo de fermentación. Por otro ladose probaron diferentes sustratos industriales ("corn mash", hidrolizado de paja de maíz) y de desecho ("whole stillage", "waste syrup") como materia prima para la fermentación por Clostridium. Se comprobó que las cepas de C. beijerinckii testadas eran capaces de producir butanol a partir de estos sustratos, siendo las cepas mutantes BP25 y 8052.11 las que mostraban una mayor producción de butanol en líneas generales. Dado que los mutantes BP25 y 8052.11 mostraban una producción de butanol superior a sus cepas parentales se quiso comprobar si este incremento en la producción de butanol iba acompañado por un incremento de la tolerancia a este compuesto. Los ensayos realizados en botella en medio líquido TYA con 1 % de butanol pusieron de manifiesto que la inhibición del crecimiento por parte del butanol era menor en los mutantes que en sus respectivas cepas parentales, lo que implicaba una mayor tolerancia a este compuesto. Para intentar dilucidar el origen del fenotipo de mayor producción y tolerancia de los mutantes BP25 y 8052.11, se secuenciaron los genomas de estos dos mutantes, así como de sus respectivas cepas parentales C. beijerinckii BA 101 y NCIMB 8052. La cepa 8052.11 mostraba 7 mutaciones puntuales en regiones codificantes del genoma que daban lugar a 5 sustituciones de aminoácidos y dos cambios de la secuencia de RNAs ribosómicos. La cepa BA 101, cuya secuenciación no ha sido publicada, portaba 8 mutaciones que daban lugar a dos señales de parada, un cambio del marco de lectura como consecuencia de una deleción y cinco sustituciones de aminoácidos. El mutante BP25 portaba 14 mutaciones en genes de proteínas que generaron 13 sustituciones de aminoácidos y la aparición de un codón de parada. En lo que respecta al genoma del mutante 8052.11, una de las mutaciones que probablemente podrían estar relacionada con su fenotipo de mayor producción y tolerancia al butanol se produjo en el gen de la sintetasa de la alarmona (p)ppGpp SpoT/RelA. Por otra parte, otra de las mutaciones que podrían haber originado el fenotipo de mayor tolerancia se encontraba en un regulador transcripcional de la familia TetR que podría estar reprimiendo la expresión de bombas de tipo RND. En lo concerniente al genoma del mutante BP25, ninguna de las 14 mutaciones en genes que mostraba respecto a BA 101 parecía poderse correlacionar de forma sencilla con la mayor producción y tolerancia, por lo que probablemente este fenotipo sería consecuencia de varias de estas mutaciones actuando de forma sinérgica. Además, la secuenciación del genoma de BA 101 puso de manifiesto que esta cepa quizás podría derivarse del mutante de C. beijerinckii SA-1 en lugar de C. beijerinckii NCIMB 8052 directamente, como se pensaba de acuerdo a la bibliografía. También se quiso saber sí C. beijerinckii sería capaz de despolimerizar la lignina rompiendo alguno de los enlaces entre los aromáticos que constituyen sus polímeros, ya que en diversas publicaciones se había visto que en las poblaciones de microorganismos degradadores de lignina en anaerobiosis abundaba el orden Clostridiales. Para ello se utilizaron dos sustratos, uno comercial (lignina alcalina kraft de sigma) y uno industrial ("whole stillage"), utilizándose cromatografía de permeación en gel (GPC) para medir la despolimerización de la lignina. Se observó que C. beijerinckii era capaz de despolimerizar ambos sustratos de acuerdo a este método de medida. Para finalizar, debido a la escasez de herramientas genéticas aptas para su uso en clostridios, se construyó un vector lanzadera E. coli/C. beijerinckii basado en el sistema de vectores modulares pSEV A. Este vector mostró ser eficiente para la sobreexpresión de genes en C. beijerinckii BA 1 O 1, sobre-expresándose 3 construcciones diferentes. La sobreexpresión de la ciclopropano sintasa, que cicla los ácidos grasos de la membrana, aumentó la tolerancia al butanol de la cepa, pero la producción de este compuesto se vio afectada de forma negativa. La sobreexpresión del operón groESL también causó un incremento de la tolerancia manteniéndose la misma producción de butanol que en la cepa parental. Por último, la sobreexpresión de la aldehído/alcohol deshidrogenasa no causó un incremento en la producción de butanol.
Asimilación de nitrato en la leguminosa modelo Lotus japonicus
(1999-12-10) Orea García, Alicia; Márquez Cabeza, Antonio José; Romero Rodríguez, José María; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Objetivos. 1. Debido a la poca información existente acerca de la asimilación de nitrato en Lotus japonicus al inicio de esta Tesis, el primer objetivo fue estudiar el crecimiento y la asimilación de nitrato (fundamentalmente niveles de actividad y proteína NR y NiR y acumulación de nitrato) en diferentes fuentes de nitrógeno y condiciones de cultivo. 2. Gracias a la disponibilidad de plantas transgénicas de Lotus japonicus transformadas con el gen de la NR de Lotus japonicus o de espinaca bajo el control de diferentes promotores (promotores constitutivos, específicos de raíces o específicos de tejidos verdes), otro objetivo fue estudiar la actividad y proteína NR en estas plantas, para comprobar si la expresión del transgén producía cambios en la distribución de la asimilación de nitrato entre las hojas y las raíces en Lotus japonicus, aspecto muy importante por ser ésta una planta asimiladora de nitrato en raíces. 3. Otro objetivo de esta Tesis ha sido la clonación del gen de la NiR y el estudio de la expresión de la NiR a nivel de actividad, proteínas y mRNA en diferentes condiciones de cultivo, completando así los estudios de Biología Molecular llevados a cabo para otras enzimas de asimilación de nitrato por otros grupos europeos. 4. Dado que la obtención de mutantes es una herramienta fundamental para el estudio de una ruta metabólica y el hecho de que Lotus japonicus sea una nueva planta modelo, uno de los objetivos más importante de esta Tesis ha sido poner en marcha un programa de mutagénesis, para la búsqueda de mutantes afectados en la asimilación de nitrato. CONCLUSIONES 1. Se ha examinado el crecimiento de Lotus japonicus en diferentes fuentes nitrogenadas, comprobándose que la mayor producción de biomasa tiene lugar cuando se utiliza el nitrato y el amonio simultáneamente como fuente de nitrógeno. El óptimo de crecimiento de Lotus japonicus, cultivada en nitrato potásico como única fuente de nitrógeno, tiene lugar a una concentración entre 4-8 mM, siendo tóxicas concentraciones superiores. 2. Lotus japonicus asimila el nitrato principalmente en raíces, siendo este un hecho característico de las leguminosas de clima templado, pero a diferencia de lo que ocurre en estas plantas, el aumento de la concentración de nitrato en el medio de cultivo no conduce a un desplazamiento de la asimilación de nitrato hacia las hojas. 3. Plantas de Lotus japonicus cultivadas en cajas de Magenta sufren una disminución de la asimilación de nitrato en raíces con el tiempo de cultivo. Esta disminución es independiente de la sal de nitrato utilizada, y no se debe a la ausencia de nitrato en el medio de cultivo o a un aumento en el pH externo. La caída de la asimilación de nitrato en raíces no va acompañada de un aumento de la asimilación de nitrato en hojas. Una situación similar se detecta también en cultivos en semilleros. 4. Tampoco se ha conseguido un cambio sustancial en la distribución de la asimilación de nitrato utilizando plantas transgénicas de Lotus japonicus sobreexpresando la proteína NR en hojas, o en plantas transgénicas que presentan disminuida la actividad NR en raíces. Debe existir, pues, un mecanismo de control global de la asimilación de nitrato en Lotus japonicus que la imposibilita para asimilar una mayor cantidad de nitrato en hojas. 5. Se ha aislado y secuenciado un cDNA de Lotus japonicus que se ha identificado como correspondiente al gen de la nitrito reductasa (Nii), siendo el primero descrito para esta enzima a partir de una genoteca de raíces de plantas y, además, de una planta asimiladora en raíces. La secuencia de aminoácidos de la NiR codificada por este cDNA se encuentra precedida por un péptido señal de 19 aminoácidos. Por comparación de la secuencia de aminoácidos deducida para la NiR de Lotus japonicus con las secuencias de las NiR de diferentes organismos fotosintéticos, se ha comprobado la presencia en dicha secuencia de los cuatro residuos de cisteína implicados en la unión de los grupos prostéticos de la NiR, así como una región en la zona N-terminal rica en aminoácidos positivos que podría interaccionar con la Fd. También ha permitido la construcción de un árbol filogenético, en el que la NiR deducida para Lotus japonicus se encuentra situada dentro del grupo de las leguminosas pero separada de las leguminosas tropicales asimiladoras de nitrato en hojas. Se ha determinado una única copia del gen Nii por genoma haploide en Lotus japonicus. 6. Los estudios de expresión a nivel de actividad, proteína y mRNA de la NiR de Lotus japonicus, han puesto de manifiesto la dependencia de la inducción de la NiR por nitrato, siendo esta a nivel transcripcional, así como la ausencia de fluctuaciones a lo largo del fotoperiodo tanto en raíces como en hojas. Los niveles de mRNA para la NiR también están sometidos a un control por la limitación de espacio para el crecimiento de la raíz. 7. Se ha llevado a cabo un programa de mutagenesis in vivo de semillas de Lotus japonicus que ha revelado que el agente mutagénico químico EMS es más eficaz que la irradiación ionizante γ. Las semillas mutagenizadas se han utilizado para aislar mutantes afectados en la asimilación de nitrato en Lotus japonicus, utilizando como método de selección la resistencia a clorato. Con este propósito se ha estudiado la toxicidad a clorato en esta planta encontrándose que el clorato per se no es capaz de inducir la actividad NR de Lotus japonicus. Por este motivo es necesario la presencia de nitrato en el medio de selección, debiendo ser la relación molar nitrato:clorato inferior a 5:1 si se quiere evitar la protección del nitrato frente a los efectos tóxicos del clorato. Además, se ha determinado que la concentración de clorato no puede ser mayor de 3 mM, si se quieren germinar las plantas directamente en el medio de selección. Con este método se han podido aislar en Lotus japonicus dos mutantes resistentes a clorato (clor1 y clor2), que heredan el carácter mutante en el 100% de la progenie, si bien la resistencia es tan solo parcial, siendo las plantas sensibles a altas concentraciones de clorato, aunque mucho menos que la estirpe silvestre. Estos mutantes no presentan alterados los niveles de actividad NR ni del nitrato acumulado, por lo que pueden estar afectados en algunos de los sistemas bifuncionales de transporte de clorato/nitrato de baja afinidad. 8. Se han podido aislar también en Lotus japonicus tres mutantes fotorrespiratorios de GS (pr1, pr2 y pr3) afectados específicamente en la isoforma plastídica, siendo Lotus japonicus la segunda especie vegetal y primera leguminosa donde se logran este tipo de mutantes. Aunque no se detecta actividad enzimática alguna asociada a la isoforma plastídica, el mutante pr1 presenta bajos niveles del polipéptido correspondiente a la isoforma plastídica y el mutante pr2 niveles indetectables. Este hecho, junto con los estudios genéticos realizados apuntan a que dichos mutantes están originados por diferentes mutaciones. La disminución de la cantidad de subunidad plastídica tiene lugar tanto en hojas como en raíces, lo que apoya la existencia de un solo gen que codifica para la GS plastídica en esta planta, y que la GS plastídica no es esencial para este proceso. 9. La transferencia de los mutantes pr1 y pr2 desde una atmósfera enriquecida en CO2 (condición no fotorrespiratoria) a aire (condición fotorrespiratoria) produce un aumento de 50 veces de contenido de amonio intracelular en hojas, corroborando el papel de la isoforma plastídica en la reasimilación del amonio que se libera por fotorrespiración. El buen crecimiento de los mutantes fotorrespiratorios de Lotus japonicus en alto CO2 y en presencia de nitrato, junto con el hecho de que los niveles de actividad total GS en raíces del mutante pr1 y el silvestre sean similares, indica la participación mayoritaria de la GS citosólica en la asimilación primaria del nitrógeno en esta planta, y que la GS plastídica no es esencial para este proceso. 10. Las actividades GS, NR y NiR no se afectan en las transiciones de alto CO2 a aire, ni en el organismo silvestre ni en el mutante pr1, indicando que el cambio metabólico producido por la ausencia de la reasimilación del amonio, ni el amonio fotorrespiratorio per se, influyen en dichas enzimas. 11. El perfil de elución de las isoformas de GS en una cromatografía de intercambio iónico para extracto crudos de Lotus japonicus es característico de esta planta y diferente del descrito para la inmensa mayoría de las especies vegetales estudiadas, en que primero eluye la isoforma plastídica y después la citosólica. Por este motivo, es recomendable no utilizar la terminología GS1 y GS2 para referirse a las isoformas citosólica y plastídica, respectivamente. También sería preciso revisar aquellos estudios sobre las proporciones de ambas isoformas basados exclusivamente en esta técnica.
Aspectos bioquímicos y genéticos de la asimilación de nitrógeno inorgánico y su regulación en cianobacterias fijadoras de dinitrógeno
(1991-01) Martín Nieto, José; Flores García, Enrique; Herrero Moreno, Antonia; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología
Avances en la producción de metabolitos secundarios de interés farmacológico a partir de material vegetal de Stevia rebaudiana, Bert
(2022-12-19) Vilariño Rodríguez, Susana; Cantos Barragán, Manuel; García Fernández, José Luis; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Hasta ahora las plantas de estevia se han empleado fundamentalmente para la obtención de edulcorantes bajos en calorías, aunque es conocida su capacidad para producir compuestos de interés en farmacología. Para optimizar la producción de dichos compuestos los ensayos acometidos en esta Tesis permiten afirmar que la combinación mas idónea para la micropropagación a partir de yemas de las variedades de estevia Criolla y Morita III es Criolla utilizando medio de cultivo de Murashige Skoog solidificado con agar sin encontrar efecto negativo alguno para el estado fisiológico y nutricional de las plántulas obtenidas de ambas variedades, siendo ésta la primera investigación que proporciona una gama de macro y micronutrientes en hojas de estevia. Respecto a la callogénesis se obtienen porcentajes de formación de callo cercanos al 100% siendo los de mejor calidad los desarrollados en condiciones de oscuridad y en medio de cultivo Murashige Skoog con adición de ácido naftil acético y kinetina. La presencia de los elicitores ácido salicílico y metil jasmonato en cultivos, tanto de plantas como de callos y células, multiplica por varias decenas de veces, respecto al control sin elicitores, la liberación al medio de una amplia gama de metabolitos secundarios. Se obtienen ácidos clorogénicos con propiedades antimicrobianas (ácidos 3 cafeoilquínico o p-cumárico), potenciadoras del sistema inmunológico (derivados de los ácidos clorogénicos o ácido ferúlico), antidepresivas (Kaempferol), contra enfermedades derivadas de disfunciones pancreáticas y hepáticas (ácido 3 cafeoilquínico) y en todos los casos con alta efectividad contra una amplia gama de cánceres.
Bioconversión de energía solar en energía química: fotoproducción de amoniaco por algas verde-azuladas
(1981) Ramos Martín, Juan Luis; García Guerrero, Miguel; Losada Villasante, Manuel; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Se ha conseguido una eficiente fotoproducción de amoniaco a partir de nitrato y N2 por las Algas Verde-Azuladas Anacystis y Anabaena tras tratar las células con bajas concentraciones de metionina-sulfoximina (MSX). Como consecuencia de la inactivación de
Biología molecular de las gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasas de cianobacterias y microalgas eucarióticas
(1999) Valverde Albacete, Federico; Serrano Delgado, Aurelio; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Se ha estudiado el sistema formado por las enzimas gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasas (GAPDH) en cianobacterias y microalgas como modelo en la bioenergética de la fotosíntesis. En cianobacterias se expresa mayoritariamente una enzima GAPDH2 anfibólica, tanto por su dependencia del cofactor nucleotídico (NAD ó NADP) como por su participación en rutas anabólicas y catabólicas, por lo que ha sido considerada como una nueva enzima por la IUBMB con el número de identificación EC 1.2.1.59. El gen gap2 que codifica esta enzima en la cianobacteria unicelular Synechocystis sp. PCC 6803 ha sido clonado por complementación funcional de un mutante gap-de E. coli, siendo la primera vez que esta estrategia se emplea con un gen implicado en la asimilación fotosintética del carbono. Su expresión es máxima en autotrofía y mínima en heterotrofía. En la microalga Chlorella fusca se encuentran tres enzimas GAPDH diferentes, dos fosforilantes (una en el cloroplasto y la otra en el citosol) y una no fosforiante citosólica. La utilización de los genes clonados y de anticuerpos monoespecificos en experimentos de "Northern" y "Western blot" ha mostrado que la enzima fosforilante cloroplástica desaparece virtualmente en presencia de glucosa en luz pero no en oscuridad, mientras que las otras dos enzimas se expresan en grado máximo en condiciones mixo-y heterotróficas. El gen que codifica la enzima GAPDH no fosforilante de guisante se ha clonado y la proteína se ha expresado en la enterobacteria E. coli, demostrándose así la funcionalidad de una posible ruta glicolítica no fosforilante sin rendimiento energético neto, que podría ser operativa en eucariotas fotosintéticos (microalgas y plantas).|
Biología molecular y celular de la alteración de la homeostasis del pirofosfato inorgánico en eucariotas
(2012-11-16) Serrano Bueno, Gloria; Hernández López, Agustín; Serrano Delgado, Aurelio; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
El PPi es un componente celular que se genera en muchas reacciones anabólicas de biosíntesis de polímeros y metabolitos (Geigenberger, Hajirezaei et al. 1998; Stitt 1998; Rojas-Beltrán, Dubois et al. 1999; Farre, Bachmann et al. 2001; Sonnewald 2001). Su hidrólisis es esencial para que esas reacciones discurran en la dirección correcta y se regenere el Pi necesario para las reacciones de fosforilación. La hidrólisis del PPi es una reacción bioquímica universal catalizada por pirofosfatasas inorgánicas (PPasas, EC 3.6.1.1). Existen algunos estudios que muestran la necesidad de PPasas para el correcto desarrollo del anabolismo celular (Heinonen et al., 2001), así como el efecto negativo de la deficiencia de estas enzimas tanto en procariotas como en eucariotas. Sin embargo, estos estudios no van más allá de postular que la carencia sPPasa genera parada del crecimiento en procariotas (Escherichia coli) (Chen et al., 1990) y es letal en eucariotas (Saccharomyces cerevisiae) (Giaever et al., 2002). En este trabajo de Tesis doctoral, se ha realizado un estudio detallado del mecanismo molecular de la toxicidad del exceso de PPi producido por la deficiencia en la sPPasa en eucariotas, así como sobre el papel fisiológico y bioquímico de dichas enzimas en los diferentes subcompartimentos celulares en los que se localizan. Objetivos: 1. Determinar el mecanismo fisiológico de la toxicidad por exceso de PPi en el modelo eucariota S. cerevisiae. 2. Analizar la relevancia de la localización núcleo-citosólica de la sPPasa Ipp1p en S. cerevisiae. 3. Expresar heterologamente diferentes sPPasas en S. cerevisiae y líneas celulares de mamífero. 4. Reproducir en la levadura el escenario metabólico del PPi citosólico de células vegetales. Conclusiones: 1. La ausencia de la sPPasa Ipp1p en la levaduras S. cerevisiae con metabolismo fermentativo genera muerte celular por autofagia, siendo uno de los mecanismos implicados el desbalance de la razón NAD+/NADH debido a la inhibición de la síntesis de NAD+ por el exceso de PPi. 2. La ausencia de Ipp1p genera parada del ciclo celular en fase S en S. cerevisiae con metabolismo respiratorio. Esta parada es reversible si se retira el exceso de PPi y se reactiva la sPPasa. 3. Ipp1p es una enzima núcleo-citosólica, cuyos niveles tanto de proteína como de actividad catalítica son menores en el compartimento nuclear que en el citosol. Esta diferencia se debe a una estricta regulación de los niveles proteícos de la Ipp1p nuclear, mediante degradación proteasómica. Esta regulación es dependiente de la actividad catalítica de hidrólisis de PPi y no de los niveles de polipéptido en sí. 4. La alta homología tanto en la conformación espacial del sitio activo, como del mecanismo catalítico, permite intercambiar sPPasas de diversas procedencias y diferentes familias en sistemas modelo eucarióticos como levadura o células de mamífero. 5. La compartimentalización nuclear de Ipp1p permite la eficiente complementación en levadura de la deficiencia en V-ATPasa mediante la expresión de una H+-PPasa localizada en la membrana vacuolar, pudiendo ser este un escenario metabólico del PPi similar al que tiene lugar en células vegetales.

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Examinando Tesis (Bioquímica Vegetal y Biología Molecular) por Título