Tesis (Bioquímica Vegetal y Biología Molecular)

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Nitrito reductasa de plantas superiores y algas
(1972-05-27) Cárdenas Torres, Jacobo; Losada Villasante, Manuel; Paneque Guerrero, Antonio; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Mecanismo de acción y regulación de complejo NADH-Nitrato reductasa de Chlorella
(1972-07-31) Vega Piqueres, José María; Losada Villasante, Manuel; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
La amplia y profunda significación biológica de la asimilación del nitrógeno nítrico en la luz radica, no solo en el hecho de que el nitrato es la principal fuente de nitrógeno que utilizan las plantas, sino también en que su reducción a amoniaco y posterior metabolismo dependen y están muy estrechamente ligados a las reacciones fotosintéticas propiamente dichas. Atendiendo a las fuentes energ éticas de que se nutre, los organismos pueden clasificarse en dos grupos: quimioergónicos y fotoergónicos. Organismos quimioergónicos son los que aprovechan la energía contenida en los alimentos que metabolizan. A este grupo pertenecen los seres más primitivos, como las bacterias, y los más evolucionados, como el hombre. Todos los organismos quimioergónicos adquieren la energía fisiológica que precisan para su funcionamiento, descomposición anaeróbica o aeróbicamente los substratos que ingieren, mediante procesos catabólicos conocidos como Fermentación y Respiración. Los organismos fotoergónicos obtienen su energía fisiológica a espesas de la luz solar, por medio de las reacciones luminosas de la FOTOSINTESIS. A este grupo pertenecen las algas y plantas superiores. En el presente trabajo hemos conseguido demostrar de manera concluyente la intervención del molibdeno en la reducción enzimática de nitrato y aclarar, de forma inequívoca, el efecto inhibidor de tungsteno en la asimilación de nitrato por el alga verde Chlorella pyrenoidosa. Un aspecto ampliamente debatido en la actualidad es la regulación del complejo NADH-nitrato reductasa. Syrett y Morris han mostrado que la asimilación de nitrato por Chlorella vulgaris es completamente inhibida por la adición de una pequeña cantidad de amonio y que esta inhibición se revierte tan pronto como el amonio se asimila. No pudieron sacar ninguna conclusión específica acerca del mecanismo de este proceso, pero si observaron que el amonio inhibía la primera etapa de la asimilación del nitrato, es decir la reducción del nitrato a nitrito. En un segundo trabajo, Morris y Syrett establecieron que la formación de nitrato reductasa en Chlorella vulgaris se reprimía por amonio. En cambio en plantas superiores, Schrader y Haheman (encontraron que el amonio no era inhibidor efectivo de la actividad o síntesis del enzima nitrato reductasa. Aunque se ha defendido repetidamente que el nitrato es el inductor nutricional de la nitrato reductasa de algas y plantas superiores, nuestras aportaciones hablan más bien a favor de la acción represora del amoniaco sobre el sistema reductor del nitrato. Como se expondrá más adelante, nuestras investigaciones han contribuido a esclarecer este susgestivo problema, habiendo conseguido demostrar de forma elegante y clara el efecto inactivador-represor del amonio en la nitrato reductasa del alga Chlorella pyrenoidosa.
El sistema reductor de nitrato de Azotobacter chroococcum
(1973-06) García Guerrero, Miguel; Losada Villasante, Manuel; Vega Piqueres, José María; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Caracterización del sistema reductor de nitrato de la estirpe M-14 del alga Chlorella fusca y de la levadura Torulopsis nitratophila
(1973-06-13) Rivas Florido, Joaquín; Paneque Guerrero, Antonio; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Nitrato reductasa de espinaca: mecanismo cinético y efectos de agentes desnaturalizantes
(1973-11) Rosa Acosta, Francisco Fernando de la; Palacián Gil, Enrique; Losada Villasante, Manuel; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Interconversión entre una forma oxidada y activa de la nitrato reductasa y otra reducida e inactiva
(1973-11-29) Gómez-Moreno Calera, Carlos; Palacián Gil, Enrique; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Los organismos que utilizan nitrato como fuente de nitrógeno poseen una única vía de reducción de este compuesto, la cual está constituida por dos pasos enzimáticos sucesivos. El primer paso, reducción de nitrato a nitrito, supone un cambio en el número de oxidación del átomo de nitrógeno de +5 a +3 y está catalizado por la nitrato reductasa, que realiza la transferencia de electrones desde el piridín nucleótico reducido hasta el nitrato. El siguiente paso, la conversión del nitrito a amonio, está catalizado por la nitrito reductasa y lleva consigo un cambio en el número de oxidación del átomo de nitrógeno de +3 a -3, es decir, es necesaria la transferencia de 6 electrones para que esta reducción tenga lugar. En el presente trabajo hemos dedicado nuestra atención solamente al nitrato reductasa.La diferencia más aparente entre las nitrato reductasas de distintos organismos consiste en la distinta especificidad para el donador de electrones que utilizan en la reducción del nitrato. Las nitrato reductasas de bacterias (1, 2, 3) y de algas y plantas superiores (4, 5, 6) utilizan específicamente NADH, mientras que las de hongos requieres NADPH como donador de electrones (7, 8, 9, 10). No obstante la distinta especificidad por los piridín nucléotidos reducidos, las nitrato reductasas de estos organismos poseen unas características funcionales muy similares. En el presenta trabajo se estudia principlamente la inactivación por piridín nucleótidos reducidos, ticies y sulfato de las nitrato reductasas de Chiorella fusca y Spinaca oleracea, con objeto de esclarecer los cambios químicos que acompañan y son causa de la inactivación, así como el papel que este proceso desempeña en la regulación in vivo del enzima.
Regulación de la actividad del complejo NADH-Nitrato reductasa de Chlorella fusca
(1974) Maldonado Ruiz, José María; Losada Villasante, Manuel; Paneque Guerrero, Antonio; Universidad de Sevilla. Departamento de Biología Vegetal y Ecología; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Parte de los resultados que se presentan en este trabajo muestran que la nitrato reductasa del alga verde Chlorella fusca, está sujeta a regulación por oxidación y reducción. El complejo enzimático puede existir en dos formas interconvertibles tanto in vitro como in vivo: Una activa, que se inactiva por reducción, y otra inactiva, que se activa por oxidación. El proceso de Interconversión in vivo está estrechamente relacionado con las reacciones fotosintéticas propiamente dichas. En el presente trabajo hemos estudiado la regulación del complejo NADH-nitrato reductasa de Chlorella fusca, tanto in vivo como in vitro, con objeto de esclarecer el mecanismo de inactivación de dicho enzima por el amoniaco. También hemos hecho un estudio profundo de la mitad NADH-diaforasa, lo que nos ha permitido comprender con mayor detalle la participación de esta primera actividad enzimática en la regulación del complejo.
Reducción enzimática de nitrato a nitrito en azotobacter chrococcum dependiente de ferredoxina
(1975-12-22) Tortolero García, María Dolores; Losada Villasante, Manuel; Paneque Guerrero, Antonio; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
Las reacciones y estructuras de las moléculas que contienen nitrógeno juegan un papel esencial en Bioquímica. Realmente la importancia de los ácidos nucleicos, proteínas, muchos coenzimas y otros compuestos nitrogenadas no puede subestimarse. Debido a que la Tierra contiene una atmósfera rica en oxígeno y, por consiguiente, proporciona un entorno oxidante, muchos elementos tienden a combinarse con el oxígeno. Así, el carbono es oxidado a Co2, el nitrógeno a NO-3, el azufre a SO2-4. La incorporación de estos elementos oxidados a la materia viviente requiere previamente su conversión a formas reducidas asimilables. La fuente última de poder reductor es la energía de la luz solar. Esta energía es capturada por las plantas verdes y por ciertos microorganismos, a través de la fotosíntesis, para liberar oxígeno molecular del agua y sintetizar compuestos orgánicos a partir del anhídrido carbónico, nitrato y sulfato. Los compuestos así sintetizados, proteínas, grasas, ácidos nucleicos y otra gran variedad de compuestos -entre los que cabe destacar los carbohidratos- serán utilizados después por el reino animal y microorganismos no fotosintéticos para ser oxidados y liberar energía. De la misma forma que el carbono pasa a través de un ciclo de oxidación, CO2 parcialmente a carbohidratos en plantas y posterior conversión a CO2 en animales, también los compuestos de nitrógeno son reducidos para conservar energía y después oxidados para proporcionar poder metabólico. En algunos microorganismos, estas reacciones de óxidoreducción del nitrógeno constituyen de hecho los pilares fundamentales de su existencia.
Nitrato reductasa de espinaca: efecto de diversos tratamientos físicos y químicos sobre las actividades catalíticas y la inactivación por piridin nucleotidos reducidos
(1975-12-22) Castillo Rodríguez, Francisco; Palacián Gil, Enrique; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Uno de los elementos biogenésicos más importante es el nitrógeno, que constituye aproximadamente un 2% del peso seco de las plantas, y que es incorporado por éstas en cantidades no inferiores a los diez mil millones de toneladas anuales. Exceptuando las especies que tienen asociaciones simbióticas con las bacterias fijadoras del nitrógeno atmosférico, la incorporación del nitrógeno a las plantas se realiza a expensas del nitrato disuelto en el agua del suelo o en las masas de agua oceánicas y fluviales.El componente nitrogenado metabólicamente utilizable por las plantas es el amonio; por tanto, l reducción del nitrato a amonio es necesaria para que las plantas puedan incorporar el nitrógeno a su metabolismo. El proceso de reducción del nitrato a amonio requiere la transferencia de ocho electrones y la intervención de dos enzimas distintos (1).La conversión enzimática del nitrato en amonio tiene lugar en dos etapas sucesivas (2, 3, 4). La primera etapa es una reacción catalizadas por la nitrato reductasa y consiste en la transferencia de dos electrones al nitrato, que se reduce a nitrito. La segunda etapa es una reacción catalizada por la nitrito reductasa, que transfiere seis electrones al nitrito y lo reduce a amonio. En ninguna de las dos etapas se ha detectado compuestos intermediarios ricos en energía o se requiere ATP.
Nitrato reductasa asimilatoria de la bacteria acinetobacter calcoaceticus
(1976-07-01) Villalobo Polo, Antonio; Cárdenas Torres, Jacobo; Losada Villasante, Manuel; Rivas Florido, Joaquín; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
La atmósfera actual de la tierra es muy oxidante pues contiene un 21% de oxígeno. Esto hace que una gran cantidad de elementos se encuentren en forma de compuestos oxidados tales como: silicatos, sulfatos, fosfatos, nitratos, carbonatos, etc. cuando un organismo necesita utilizar cualquiera de estos elementos como fuente para la síntesis de sus distintos componentes celulares, requiere reducirlos previamente a un estado de valencia utilizable. En el caso de los organismos que asimilan nitrógeno nítrico, la reduccón de nitrato a amoniaco, utilizable ya directamente para la síntesis del material celular nitrogenado, se realiza en dos pasos enzimáticos bastante bien caracterizados: 1) el nitrato se reduce a nitrito en una reacción catalizada por la nitrato reductasa (cambio de valencia del nitrógeno de +5 a +3); 2) el nitrito resultante se reduce a amoniaco, mediante una reacción en la que interviene el enzima nitrito reductasa (cambio de valencia del nitrógeno de +3 a -3). La reducción de nitrato hasta amoniaco se ha estudiado a fondo en plantas superiores y algas verdes habiéndose caracterizado los enzimas que participan en el proceso, así como su mecanismo de regulación. En ciertas levaduras y hongos, la asimilación del nitrógeno nítrico sigue esencialmente los mismos pasos enzimáticos encontrados en plantas superiores y algas, y los requerimientos básicos de donadores de electrones, cofactores y metales así como su mecanismo de regulación resultan ser notablemente similares. En el caso de los procariontes, a excepción de unos cuantos organismos bien caracterizados, el proceso de reducción de nitrato no está tan bien estudiado y sólo se posee una información fragmentaria. Las bacterias utilizan el nitrato de dos maneras diferentes. Ciertos microorganismos bacterianos no fotosintéticos, son capaces de llevar a cabo una reducción desasimilativa del nitrato, también conocida como respiración de nitrato. En estas bacterias, el nitrato se reduce a nitrito, actuando aquel, en lugar del O2, como último aceptor de la cadena de transporte de electrones respiratoria. El nitrito producido se transforma generalmente en distintos compuestos nitrogenados (NO, N2O, N2) produciéndose así un empobrecimiento del contenido en nitrógeno en los ambientes donde viven estos microorganismos que por ello se denominan desnitrificantes. Al parecer, en este proceso participan entre el reductor y el sustrato aceptor último, unos transportadores de electrones similares a los de la cadena de transporte mitocondrial (flavoproteínas, quinonas, citocromos, etc.) así como ciertos metales susceptibles de experimentar reacciones redox reversibles. El enzima que interviene en la reducción de nitrato a nitrito como (último eslabón de la cadena de transporte respiratoria bacteriana, también llamada nitrato reductasa respiratoria, ha sido caracterizada en E. coli K-12, Micrococcus denitrificans y Micrococcus halodenitrificans. Se trata de un enzima asociado a membranas, de alto peso molecular y que contiene molibdeno, hierro no hemínico y grupos sulfuro lábiles, que al parecer son indispensables para la función catalítica de la proteína. Otro, tipo de reducción de nitrato operado por las bacterias es el de la reducción asimilativa, mediante el cual, el nitrato es reducido a nitrito en un primer paso, y en una ulterior reducción convertido en amoniaco. El enzima que participa en el primer paso del proceso, llamada nitrato reductasa asimilatoria ha sido caracterizada recientemente en algunos procariontes. En general, en estos organismos el enzima se encuentra asociado a partículas y la ferredoxina reducida es el donador inmediato de electrones en la reducción de nitrato a nitrito y sólo en unos cuantos casos en ciertas condiciones parece ser que el NADH actúa como donador en el proceso lo cual contrasta con los requerimiento del complejo nitrato reductasa de algas verdes, plantas superiores, hongos y levaduras que dependen exclusivamente de NAD(P)H. los viológenos reducidos sustituyen eficazmente a la ferredoxina y el enzima no parece requerir FAD para su actividad. Por el contrario la nitrato reductasa del grupo de organismos antes mencionado es un complejo enzimático de alto peso molecular que contiene flavina, molibdeno y citocromo b, y con dos actividades que actúan secuencialmente, entre el donador de electrones primario y el nitrato. La nitrato reductasa asimilatoria de procariontes no fotosintéticos ha sido menos estudiada. Hasta muy recientemente se sabía que este enzima, a diferencia de la nitrato reductasa respiratoria, no estaba asociada a membranas, no reducía clorato o bromato además del nitrato, y eran insensibles al tratamiento con azida. En nuestro laboratorio, se ha aislado y caracterizado la nitrato reductasa asimilatoria de Azotobacter chroococcum. Es un enzima de peso molecular 100.000, que contiene molibdeno, utiliza la ferredoxina o los viológenos reducidos como donadores de electrones, puede existir en dos formas enzimáticas interconvertibles, activa e inactiva y cuya síntesis se reprime por amoniaco y se induce por nitrato. Últimamente se ha conseguido reducir el nitrato en dicha bacteria con NAD(P)H mediante diaforasas presentes en el microorganismo, capaces de transportar los electrones a los viológenos que, una vez reducidos, pueden llevar a cabo la reducción del nitrato en presencia de la nitrato reductasa. El objeto de este trabajo es la caracterización de la nitrato reductasa de la bacteria Acinetobacter calcoaceticus. Esta bacteria pertenece al amplio grupo de las Moraxellas, oxidasanegativa. Es un cocobacilo, Gran-negativo, quimioorganotrofo, aerobio estricto, incapaz de fijar nitrógeno o de reducción desasimilativa del nitrato que utiliza una amplia gama de compuestos orgánicos como fuente de carbono puede asimilar nitrato. Excepto la antedicha capacidad de reducir nitrato por estos organismos nada se conocía sobre el enzima nitrato reductasa. Los resultados que presentamos a continuación pueden resumirse en los siguientes puntos: 1) Aislamiento y caracterización de la nitrato reductasa de Acinetobacter calcoaceticus. 2) Purificación de la ferredoxina de Acinetobacter calcoaceticus y del papel de este transportador en el proceso de asimilación de nitrato en este organismo. 3) Aislamiento y caracterización de las diaforasas dependientes de NAD(P)H, presentes en esta bacteria y determinación de su posible participación en la asimilación de nitrato. Parte de este trabajo ha sido publicado y comunicado en varios congresos nacionales e internaciones. Algunos experimentos han sido presentados como parte de la Tesis de Licenciatura.
Reactivación por luz azul de la nitrato reductasa de algas verdes y plantas superiores
(1976-09) Roldán Nogueras, José Manuel; Aparicio Alonso, Pedro J.; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Aislamiento y caracterización bioquímica de mutantes de Chlamydomonas reinhardi afectados en su capacidad de asimilar nitrato
(1976-11) Sosa Suárez, Francisco Manuel; Cárdenas, Jacobo; López Barea, Juan; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
La reducción fotosintética del nitrato en el alga verde-azulada Anacystis nidulans
(1977-09-23) Manzano Harriero, José Carlos; García Guerrero, Miguel; Losada Villasante, Manuel; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Prácticamente toda la energía que recibe la superficie de la Tierra procede del Sol. Día tras días, desde hace millones de años, la luz y otras radiaciones que la acompañan dejan el Sol y pasan al espacio. Parte de estas radiaciones llega a la Tierra y cae sobre la Biosfera, donde la energía realiza un ciclo abierto, de manera que toda la energía solar que recibe la emite, en último término, en forma de radiación calorífica.La vida en sí, como señaló Shrödinger (1945), va así acompañada toda ella de un flujo de energía que sigue un comportamiento termodinámico similar al encontrado en cualquier entidad físico-química. La característica esencial de la vida -ser capaz de crear y mantener una condición de baja entropía, o lo que es lo mismo, un elevado grado de “orden” interno- se consigue mediante una continua disipación de energía de alta utilidad (luz o alimentos) que se convierte en energía de baja utilidad (calor).De esta forma, la vida -al menos en nuestra biosfera se organiza manteniéndose sobre un sistema disipativo de energía, con una fuente constituida fundamentalmente por el Sol y un sumidero que es el espacio sideral hacia el que nuestro sistema irradia. No se puede concebir la Biosfera sin un flujo de energía, el cual se basa en la absorción de energía solar a nivel de los organismos autótrofos, mediante la captación de fotones por el proceso denominado Fotosíntesis.En el presente trabajo se describe el estudio del sistema asimilatorio de reducción del nitrato presente en el alga verde-azulada Anacystis nidulans, abarcando los niveles celular, subcelular y enzimático del proceso. Un punto fundamental del trabajo lo constituye el estudio de las propiedades de nitrato reductasa y nitrito reductasa, enzimas componentes del sistema, y la caracterización de la ferredoxina reducida como el donador inmediato de electrones para ambos enzimas. Asimismo, la obtención de partículas subcelulares fotosintéticamente activas, y conteniendo los enzimas del sistema reductor del nitrato, ha posibilitado la primera demostración concluyente de la naturaleza fotosintética de la reducción asimilatoria de nitrato a amoniaco.
Caracterización y regulación de la fotorreducción de nitrato en la bacteria verde-azulada Nostoc muscorum
(1977-11) Ortega Peralías, Trinidad; Cárdenas, Jacobo; Castillo, Francisco; Universidad de Sevilla. Departamento de Biología Celular
Mecanismo de interconversión de la actividad nadh-nitrato reductasa de Chlorella fusca
(1978) Chaparro Muñoz, Alicia; Relimpio Ferrer, Ángel María; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Purificación hasta homogeneidad y estudios de regulación del complejo enzimático nad(p) h-nitrato ruductasa del alga verde "Ankistrodemus braunii"
(1978) Diez Dapena, Jesús; Vega Piqueres, José María; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
En este trabajo se ha estudiado el complejo enzimático NADCPJH-NITRATO reductasa de Ankistrodesmus braunii tanto en lo que respecta a su composición como a su mecanismo de regulación pudiendo agruparse los resultados alrededor de tres puntos fund ... amentales: a) La puesta a punto de un método de purificación que permite obtener cantidades significativas de enzima de gran calidad en lo que se refiere a su actividad específica y pureza. b) La caracterización del grupo hemo componente de la nitrato reductasa de Ankistrodesmus braunii.c) El estudio del mecanismo de regulación del enzima tanto a nivel de síntesis como de actividad y en este último caso in vivo e in vitro.|
Estudios a nivel celular de la asimilación del nitrato en Chlorella fusca. Papel regulador del amoniaco y de la luz azul
(1978-12) Calero Santiago, Fernando; Aparicio Alonso, Pedro J.; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Nitrato reductosa de Azotobacter chroococcum. Inactivación por agentes oxidantes y su reversión por Ditioeritritol
(1978-12) Vila Vilar, Reyes; Paneque Guerrero, Antonio; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Purificación y propiedades de la ferredoxina-nitrato reductasa de la cianobacteria "Anacystis nidulans"
(1979) Candau Chacón, Pedro; Manzano Harriero, José Carlos; García Guerrero, Miguel; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
El nitrógeno es uno de los elementos cualitativa y cuantitativamente más importantes de la materia viva, en la que se encuentra como componente de algunas de las biomoléculas más representativas, tales como proteínas y ácidos nucléicos. La vía de entrada del nitrógeno en los seres vivos es el Reino Vegetal, a través del cual llega a los animales en el estado de máxima reducción correspondiente al nitrógeno orgánico. También las plantas necesitan que el nitrógeno esté reducido al máximo para poder combinarlos con compuestos carbonados y formar así los distintos compuestos nitrogenados de sus células. Sin embargo, a diferencia de los animales, las plantas tienen la capacidad de utilizar el nitrógeno inorgánico existente en la Naturales, el cual reducen hasta amonio previamente a su incorporación. Con excepción de un pequeño grupo de organismos capaces de fijar el nitrógeno atmosférico, la forma nitrogenada más utilizada es el nitrato, de los que da ide el hecho de que se reduzcan anualmente unos 10.000 millones de toneladas de este compuesto (Beevers y Hageman, 1969; Losada, 1972). La utilización de nitrato como fuente nitrogenada no está restringida a ningún grupo de organismos, sino que es general, siendo realizada tanto por algas y plantas superiores, como por distintos géneros de hongos y bacterias. La diferencia existente entre los estados de reducción que presenta el nitrógeno en el nitrato, +5, y en el amonio, -3, implica la necesidad de una transferencia de 8 electrones que, como ha quedado firmemente establecido, ocurre en sólo dos etapas: a) reducción de nitrato a nitrito, catalizada por el enzima nitrato reductasa, y b) reducción de nitrito a amonio, mediada por la nitrito reductasa, en reacciones que implican 2 y 6 electrones respectivamente (Beevers y Hageman, 1969, 1972; Hewitt, 1975; Hewitt et al., 1976; Losada, 1976; Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979). La reducción de nitrato a nitrito está catalizada por una molibdoproteína, la nitrato reductasa, que ha sido estudiada exhaustivamente en los últimos años. El enzima de organismos eucarióticos se ha clasificado como NAD(P)H-nitrato reductasa, atendiendo a la naturaleza de su donador fisiológico de electrones, los piridín nucleótidos reducidos. La nitrato reductasa de eucariotas fotosintéticos muestra una preferencia por NADH como donador de electrones, habiendo sido purificado a homogeneidad recientemente en el alga verde Chlorella vulgaris. En la NADH-nitrato reductasa de este alga se ha determinado la existencia de tres subunidades de 95-100 KD como constituyentes de un enzima de 356 KD de peso molecular, que contiene como grupos prostéticos 2 moléculas de FAD, dos grupos hemo del tipo b, y 2 átomos de molibdeno (Solomonson et al., 1975). La situación en hongos, es similar, a excepción de la preferencia del enzima por NADPH, encontrándose también FAD, hemo b, y molibdeno en la molécula, si bien son solo dos las subunidades presentes (115 KD cada una) siendo, consecuentemente, su peso molecular (230 KD) inferior al de eucariotas fotosintéticos (Garret y Nason, 1969; Pan y Nason, 1979). En eucariotas, la transferencia de los electrones al nitrato está mediada por dos actividades enzimáticas que operan secuencialmente y que, aunque no se han logrado separar físicamente, pueden ser ensayadas independientemente y se afectan de forma específica por distintos inhibidores y tratamientos. La primera de estas actividades es una NAD(P)H-diaforsa, que contiene FAD y que por ser la captadora de electrones es la que marca la especificidad por NADH ó NADPH en cada caso. La segunda actividad del complejo enzimático NAD(P)H-nitrato reductasa es la nitrato reductasa terminal, también denominada FNH2-nitrato reductasa, por su capacidad de utilizar flavín-nucleótidos (o viológenos) reducidos, como donadores de electrones. Estudios fisicoquímicos y enzimáticos de diversa índole han determinado que el molibdeno está implicado en esta segunda actividad, pensándose que este metal interacciona directamente con el nitrato. El papel de los grupos hemo, así como su participación en una u otra actividad, permanece aún si aclarar definitivamente (Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979). A diferencia de lo que ocurre con la nitrato reductasa de eucariotas, que se considera soluble, en organismos procarióticos el enzima se encuentra, en general, unido a membranas de tipo fotosintético o respiratorio. En estos organismos parece no existir una actividad diaforásica similar a la del enzima de eucariotas, encontrándose que los piridín nucleótidos reducidos no se comportan como donadores de electrones adecuados para estos enzimas, si bien se han descrito casos en los que se observaba reducción de nitrato con NADH en preparaciones de membranas de bacterias fotosintéticas y cianobacterias (Hattori y Myers, 1967; Hattori, 1970; Katoh, 1963). La ferredoxina, una proteína sulfoférrica de potencias muy negativo, es el principal candidato para desempeñar el papel de donador de electrones fisiológico de la nitrato reductasa de procariotas, habiendo sido descrita su participación en la reducción de nitrato en algunos organismos tanto fotoergónicos como quimioergónicos. En procariotas fotosintéticos, cianobacterias y bacterias fotosintéticas, la ferredoxina reducida por el fotosistema I podría ser el donador fisiológico de electrones para el enzima, si bien en bacterias no fotosintéticas la baja actividad de reducción observada con ferredoxina y la necesidad de utilizar sistemas exógenos para reducirla, dejan abierto a discusión su posible papel como donador fisiológico (Losada y Guerrero, 1979). En la actualidad, la única nitrato reductasa de procariotas que se ha conseguido purificar hasta un nivel aceptable (95% de pureza) ha sido la de la bacteria fotosintética Rhodopseudomonas capsulata, encontrándose, tras una purificación de solo 60 veces, que la proteína, de peso molecular 185 KD, tiene dos subunidades iguales de 85 KD cada una, no presenta FAD y sí un átomo de molibdeno y 1 ó 2 grupos de hemo c por molécula (ALef y Klemme, 1977, 1979). El enzima no acepta electrones de los piridín nucleótidos reducidos, siendo su donador fisiológico desconocido por el momento. La baja actividad específica (menos de 1 U/mg proteína), así como el hecho de que preparaciones menos purificadas tuviesen actividades específicas superiores, es explicado por estos autores como la consecuencia de una destrucción parcial del enzima durante la purificación (Alef y Klemme, 1979). Esto significa que aún cuando el enzima esté purificado, el conocimiento que de él se tiene es escaso y además basado en un enzima de cuya integridad se duda. El segundo enzima de la ruta de reducción de nitrato, la nitrito reductasa, ha sido identificado en eucariotas fotosintéticos como una ferroproteína de 63 KD de peso molecular que carece de FAD y contiene un grupo sirohemo y un centro sulfoférrico del tipo {Fe4-S4*} (Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979; Cárdenas et al., 1979; Lancaster et al., 1979). A diferencia de la nitrito reductasa de hongos, que contiene FAD que acepta electrones de los piridín nucleótidos reducidos, la nitrito reductasa de algas verdes y plantas superiores, utiliza la ferredoxina reducida fotosintéticamente como donador de electrones (Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979; Cárdenas et al., 1979), al igual que se ha encontrado para nitrito reductasa de cianobacterias (Manzano et al., 1976; Manzano, 1977; Méndez, 1979). Las cianobacterias (alga verde-azuladas) constituyen un grupo perfectamente delimitado de microorganismos cuya presencia sobre la Tierra data de al menos 2.800 millones de años (Schopf, 1970). La singularidad de este grupo reside en unir a una estructura celular procariótica, un aparato fotosintético capaz de utilizar el agua como donador de de electrones, lo que le confiere una situación de puente entre las bacterias y las plantas superiores, de indudable interés evolutivo, y biológico en general (Fogg et al., 1973; Stanier y Cohen-Bazire, 1977). De igual forma que otros organismos fototrofos, las cianobacterias asimilan compuestos de nitrógeno inorgánico tales como nitrato, nitrito o amonio (Allen y Arnon, 1955), presentando algunas de ellas la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (Fogg et al., 1973). La importancia cuantitativa de la asimilación del nitrógeno inorgánico por estos organismos puede resaltarse señalando que el nitrógeno constituye del 4 al 9% del peso seco de las células. En contraposición con el sistema reductor de nitrato de plantas superiores, algas y hongos, la información existente sobre el proceso de reducción de nitrato en cianobacterias es bastante escasa, aunque se ha demostrado que la reducción transcurre vía nitrito en dos reacciones enzimáticas consecutivas (Hattori, 1962; Manzano et al., 1976, Manzano, 1977). La nitrato reductasa de estos organismos se encuentra unida a membranas, pudiendo ser solubilizada por diversos procedimientos obteniéndose un enzima que es activo con donadores artificiales pero que no puede aceptar electrones de los piridín nucleótidos (Hattori Myers, 1966, 1967; Hattori, 1970; Hattori y Uesugi, 1968a; Manzano et al., 1976). Preparaciones particuladas de Anabaena cylindrica catalizan la reducción de nitrato con ferredoxina como donador cuando se preparan empleando ultrasonidos, mientras que si se utilizan acetona para ello es el NADH y no la ferredoxina el donador de electrones efectivo encontrado (Hattori Myers, 1967). Cuando el enzima se solubiliza, solo los flavín nucleótidos, o los viológenos, reducidos sirven como donadores de electrones (Hattori, 1970). Sistemas reconstruidos de Anabaena cylindrica, empleando el sistema ascorbat/DPIP como donador de electrones del fotosistema I, llevan a cabo la reducción de nitrato y nitrito dependiente de ferredoxina (Hattori Uesugi, 1968b). En Anacystis nidulans y Nostoc muscorum se ha descrito la reducción fotosintética de nitrato por preparaciones de membranas que llevaban asociadas la actividad nitrato reductasa (Manzano et al., 1976; Ortega et al., 1976). La ferredoxina parece ser el transportador de electrones entre el fotosistema I y el enzima, si bien en su ausencia aún tenía lugar una apreciable reducción de nitrato. Utilizando enzima soluble de A. nidulans ligeramente purificado se ha comprobado que la ferredoxina reducida por el sistema NADPH/NADP reductasa de espinacas, era capaz de donar electrones a la nitrato reductasa (Manzano et al., 1976; Manzano, 1977). La reducción de nitrato en cianobacterias es un proceso íntimamente ligado a la fotosíntesis, habiéndose conseguido acoplar en preparaciones de membranas de A. nidulans, el poder reductor generado a partir del agua por el aparato fotosintético a la reducción de nitrato a amonio, con desprendiendo estequiométrico de oxígeno (Candau et al., 1976). En el presente trabajo se presentan evidencias aclaratorias de algunos puntos conflictivos sobre la reducción de nitrato en cianobacterias y se aportan otras nuevas relativas a la participación de la ferredoxina como donador inmediato de electrones para la nitrato reductasa de A. nidulans. Se ha desarrollado un procedimiento general de purificación de enzimas dependientes de ferredoxina, por cromatografía de afinidad redox en geles de ferredoxina-Sefarosa, que se ha aplicado con éxito a la purificación hasta homogeneidad de NADP reductasa y nitrato reductasa de A. nidulans, habiéndose estudiado en especial algunas de las propiedades de este último enzima.
Purificación y caracterización de la ferredoxina-nitrito reductasa de la cianobacteria Nostoc Muscorum
(1979-09-14) Méndez Jiménez, José Miguel; Vega Piqueres, José María; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular

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