Resumen | La humanidad se ha valido históricamente de diferentes microorganismos fermentativos para la modificación de distintos tipos de alimentos y bebidas. Sin embargo, los microorganismos fermentativos no solo se han utilizado ...
La humanidad se ha valido históricamente de diferentes microorganismos fermentativos para la modificación de distintos tipos de alimentos y bebidas. Sin embargo, los microorganismos fermentativos no solo se han utilizado para estos fines, sino, además, para la generación de otros compuestos de valor, como es el caso del butano!. La producción fermentativa de butano!, mediante el uso de clostridios solventogénicos, fue de gran importancia durante la primera mitad del siglo XX, tanto para la industria armamentística en la producción de munición, como para la industria automovilística en la producción de lacas. Sin embargo, la producción fermentativa de este compuesto acabó siendo sustituida por la síntesis petroquímica que ofrecía unos menores costes de producción.
Desde finales del siglo XX se ha experimento una creciente concienciación social respecto a los problemas medioambientales, especialmente a los relacionados con el cambio climático. Una de las principales fuentes de contaminación atmosférica es debida al uso de combustibles fósiles. Por este motivo, se han buscado alternativas más sostenibles y menos contaminantes que éstos, tales como los biocombustibles. A pesar de que el bioetanol es el biocombustible más utilizado en la actualidad, el butanol presenta unas propiedades físico-químicas superiores como su mayor contenido energético.
Para que se pueda volver a retomar la producción industrial fermentativa del butanol sería imprescindible aumentar la producción de este compuesto. Para conseguir esta meta sería necesario tanto la optimización de los procesos, como la búsqueda de sustratos fermentativos baratos o de desecho, así como la mejora genética de las cepas productoras de esta sustancia. Los clostridios solventogénicos son microorganismos que muestran dos fases metabólicas. Una primera fase, llamada acidogénica, durante la que se produce el crecimiento exponencial, así como la producción de los ácidos acético y butírico, fundamentalmente, y una segunda fase, denominada solventogénica, en la que se producen los disolventes acetona, butanol y etanol, en parte gracias a la re-asimilación de los ácidos previamente generados, así como la producción de esporas. La reasimilación de los ácidos a disolventes es, en parte, un mecanismo para reducir la toxicidad de los primeros, sin embargo, los disolventes y en especial el butanol, son compuestos altamente tóxicos para las células, por lo que la generación de esporas supondría en parte un mecanismo de supervivencia frente a estos compuestos.
El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue la generación de cepas mutantes de C/ostridrium beijerinckii NCIMB 8052 y C. beijerinckii BA 101, que mostrasen una mayor producción de butanol que sus respectivas cepas parentales. Se decidió llevar a cabo una mutagénesis química al azar principalmente porque los mutantes obtenidos mediante esta técnica no son considerados como organismos genéticamente modificados, de acuerdo a la legislación europea, lo que puede facilitar su uso a nivel industrial.
En primer lugar, se optimizaron las condiciones de la mutagénesis con el agente etilante EMS y se probaron tres estrategias de cribado indirectas para encontrar mutantes con una capacidad de producción de butanol superior. La estrategia más eficiente fue la utilización de placas de TYA con púrpura de bromocresol para detectar mutantes con una menor producción de ácidos, lo que en ocasiones puede correlacionarse con una mayor producción de disolventes, entre los que se encuentra el butanol. De entre todos los mutantes analizados se seleccionaron dos que mostraban una producción de butanol más elevada que sus respectivas cepas parentales, C. beijerinckii BP25 derivado de la cepa C. beijerinckii BA 101 y C. beijerinckii 8052.11 generado a partir de C. beijerinckii NCIMB 8052. Para evaluar la producción de butanol de estas cepas mutantes, se realizaron cultivos en medio TY A, por un lado, a escala de botella y por otro en fermentadores de un litro. En los cultivos en botella en medio TYA se comprobó que mientras que la cepa C. beijerinckii NCIMB 8052 no producía butanol, como consecuencia de una excesiva acidificación del medio, su mutante 8052.11 era capaz de producirlo. Por su parte, el mutante BP25, generado a partir de C. beijerinckii BA 101, mostró una tendencia a una mayor producción de butanol que su cepa parental. En lo que respecta a los cultivos en fermentador con control de pH a 5,5, se comprobó que la cepa silvestre NCIMB 8052 era capaz de producir butanol, si bien su cepa mutante 8052.11 producía un mayor título de este compuesto. La cepa BP25 también mostraba una producción de butanol superior que su cepa parental BA101.
También se variaron distintos parámetros de cultivo a nivel de botella. Se observó cómo el aumento de la presión en el espacio de cúpula de la botella, debido a los gases generados durante la fermentación, podía tener efectos negativos sobre la producción e butanol. Asimismo, se vio que los cultivos realizados a 34ºC en lugar de a 37ºC, a pesar de mostrar una productividad más baja, alcanzaban una mayor producción final de butanol. Por último, se observó que al realizar los cultivos en agitación se incrementaba la productividad, alcanzándose la concentración máxima de butanol en el medio en un menor tiempo de fermentación.
Por otro ladose probaron diferentes sustratos industriales ("corn mash", hidrolizado de paja de maíz) y de desecho ("whole stillage", "waste syrup") como materia prima para la fermentación por Clostridium. Se comprobó que las cepas de C. beijerinckii testadas eran capaces de producir butanol a partir de estos sustratos, siendo las cepas mutantes BP25 y 8052.11 las que mostraban una mayor producción de butanol en líneas generales.
Dado que los mutantes BP25 y 8052.11 mostraban una producción de butanol superior a sus cepas parentales se quiso comprobar si este incremento en la producción de butanol iba acompañado por un incremento de la tolerancia a este compuesto. Los ensayos realizados en botella en medio líquido TYA con 1 % de butanol pusieron de manifiesto que la inhibición del crecimiento por parte del butanol era menor en los mutantes que en sus respectivas cepas parentales, lo que implicaba una mayor tolerancia a este compuesto.
Para intentar dilucidar el origen del fenotipo de mayor producción y tolerancia de los mutantes BP25 y 8052.11, se secuenciaron los genomas de estos dos mutantes, así como de sus respectivas cepas parentales C. beijerinckii BA 101 y NCIMB 8052. La cepa 8052.11 mostraba 7 mutaciones puntuales en regiones codificantes del genoma que daban lugar a 5 sustituciones de aminoácidos y dos cambios de la secuencia de RNAs ribosómicos. La cepa BA 101, cuya secuenciación no ha sido publicada, portaba 8 mutaciones que daban lugar a dos señales de parada, un cambio del marco de lectura como consecuencia de una deleción y cinco sustituciones de aminoácidos. El mutante BP25 portaba 14 mutaciones en genes de proteínas que generaron 13 sustituciones de aminoácidos y la aparición de un codón de parada. En lo que respecta al genoma del mutante 8052.11, una de las mutaciones que probablemente podrían estar relacionada con su fenotipo de mayor producción y tolerancia al butanol se produjo en el gen de la sintetasa de la alarmona (p)ppGpp SpoT/RelA. Por otra parte, otra de las mutaciones que podrían haber originado el fenotipo de mayor tolerancia se encontraba en un regulador transcripcional de la familia TetR que podría estar reprimiendo la expresión de bombas de tipo RND. En lo concerniente al genoma del mutante BP25, ninguna de las 14 mutaciones en genes que mostraba respecto a BA 101 parecía poderse correlacionar de forma sencilla con la mayor producción y tolerancia, por lo que probablemente este fenotipo sería consecuencia de varias de estas mutaciones actuando de forma sinérgica.
Además, la secuenciación del genoma de BA 101 puso de manifiesto que esta cepa quizás podría derivarse del mutante de C. beijerinckii SA-1 en lugar de C. beijerinckii NCIMB 8052 directamente, como se pensaba de acuerdo a la bibliografía.
También se quiso saber sí C. beijerinckii sería capaz de despolimerizar la lignina rompiendo alguno de los enlaces entre los aromáticos que constituyen sus polímeros, ya que en diversas publicaciones se había visto que en las poblaciones de microorganismos degradadores de lignina en anaerobiosis abundaba el orden Clostridiales. Para ello se utilizaron dos sustratos, uno comercial (lignina alcalina kraft de sigma) y uno industrial ("whole stillage"), utilizándose cromatografía de permeación en gel (GPC) para medir la despolimerización de la lignina. Se observó que C. beijerinckii era capaz de despolimerizar ambos sustratos de acuerdo a este método de medida.
Para finalizar, debido a la escasez de herramientas genéticas aptas para su uso en clostridios, se construyó un vector lanzadera E. coli/C. beijerinckii basado en el sistema de vectores modulares pSEV A. Este vector mostró ser eficiente para la sobreexpresión de genes en C. beijerinckii BA 1 O 1, sobre-expresándose 3 construcciones diferentes. La sobreexpresión de la ciclopropano sintasa, que cicla los ácidos grasos de la membrana, aumentó la tolerancia al butanol de la cepa, pero la producción de este compuesto se vio afectada de forma negativa. La sobreexpresión del operón groESL también causó un incremento de la tolerancia manteniéndose la misma producción de butanol que en la cepa parental. Por último, la sobreexpresión de la aldehído/alcohol deshidrogenasa no causó un incremento en la producción de butanol.
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