Control de la procesividad de la resección por las proteinas CTIP, BRCA1 y las topoisomerasas del tipo II

Abstract

Las cadenas de ADN pueden sufrir roturas debido a la acción de agentes exógenos, principalmente mutágenos químicos o radiaciones, o por factores endógenos, como la transcripción, la replicación o las especies reactivas de oxígeno derivadas del metabolismo celular. Las roturas de doble cadena, DSBs (Double Strand Breaks, por sus siglas en inglés) son la mayor alteración que puede sufrir el ADN, y pueden provocar la aparición de mutaciones, un aumento de la inestabilidad cromosómica o la muerte celular, lo que puede dar lugar a enfermedades tan graves como el cáncer o el envejecimiento prematuro. Para reparar los DSBs las células poseen dos mecanismos principales, excluyentes entre sí. El proceso de unión de extremos no homólogos (non-homologous end joining, NHEJ), o la recombinación homóloga (HR). El primero consiste en la ligación de dos fragmentos de ADN adyacentes. Por el contrario, la HR utiliza una secuencia homóloga como molde para reparar los daños. Se ha descrito que la elección de la vía de reparación depende del procesamiento nucleolítico a ambos extremos del corte, este proceso es llamado resección, generando así una región de cadena sencilla de ADN que es rápidamente cubierta por la proteína de replicación A (RPA). Muchos investigadores han utilizado la detección microscópica de RPA u otras proteínas asociadas a HR para evaluar la progresión a través de las diversas etapas de esta vía de reparación. Los defectos en la formación de focos de RPA medidos por estos métodos son claros cuando las proteínas claves del proceso de resección están mutadas o ausentes. Investigaciones recientes han puesto de manifiesto el hecho de que existen proteínas que juegan un papel modulador en este proceso, pero cuya depleción o mutación causa fenotipos a menudo demasiado sutiles para ser cuantificados por dichos ensayos de microscopía. Para aumentar la sensibilidad de los estudios de resección en células humanas, en este trabajo generamos una técnica de alta resolución para el análisis de moléculas de ADN una a una. De este modo, podremos cuantificar la extensión de la resección a nivel molecular. Este método al que llamamos Single Molecule Analysis of Resection Tracks (SMART) nos permitirá analizar fenotipos más sutiles, y así descubrir nuevos factores implicados en la reparación de los DSBs. Concretamente, logramos estandarizar la técnica SMART, midiendo por primera vez la velocidad de la resección del ADN en células humanas, y tal como esperábamos, la depleción de CtIP, una proteína clave en el proceso de resección, redujo drásticamente la velocidad de la resección. Además, analizando al interactor de CtIP, BRCA1, encontramos que esta interacción no es esencial para el proceso de resección, aunque si regula la velocidad del proceso. Aprovechando el potencial de nuestra técnica para el estudio de nuevos factores involucrados en la reparación de los DSBs analizamos el papel de las topoisomerasas tipo II en resección. Mediante el uso de técnicas clásicas y SMART en combinación con inhibidores de topoisomerasas, depleciones o mutaciones knock out hemos encontrado que, efectivamente, estas enzimas facilitan dicho proceso. Por lo tanto, describimos un nuevo papel de las topoisomerasas tipo II como un ayudante para la resección del ADN.