eL15 and eL22 proteins and their functional environments during ribosome assembly in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Ribosomes are ribonucleoprotein complexes in charge of protein translation. Translation is an essential process in all organisms that involves decoding the information contained in mRNAs (messenger RNAs) to generate proteins. Similarly, the process of ribosome biogenesis represents a critical pathway for all cells. Ribosomes are comprised of two different subunits, one large and one small, also named 60S and 40S, respectively, in eukaryotes, among them Saccharomyces cerevisiae, which is the model organism employed in this thesis. As ribosome biogenesis is well conserved among different eukaryotes, S. cerevisiae is a perfectly appropriate organism for this study. Ribosomes of S. cerevisiae are composed of 79 ribosomal proteins and 4 ribosomal RNAs (rRNAs), three of them in the large (25S, 5.8S y 5S) and one in the small ribosomal subunit (18S). The biogenesis of ribosomes is an extraordinarily complex process, in which in addition of the four rRNAs and the 79-80 ribosomal proteins, take part about 100 small nucleolar RNAs (snoRNAs) and more than 300 assembly protein factors, which are not present in the mature subunits and therefore are also known as trans-acting factors. The synthesis of ribosomes is a sequential process highly regulated and organized that starts in the nucleolus and orderly progresses through the nucleoplasm; almost mature ribosomal particles are exported to the cytoplasm, where the last steps of maturation take place, previously to their involvement in the translation process. The role of the different components participating in the biogenesis of the ribosomal subunits has been broadly studied through last decades. However, there are numerous assembly factors and some ribosomal proteins which still await characterization. This was the case for the ribosomal proteins eL22 and eL15 during the assembly of the 60S ribosomal subunit before the study performed in this doctoral thesis. With respect to the eL22 ribosomal protein, in this thesis, we have observed that, although, in laboratory conditions, this protein is not essential for survival, cell growth and ribosome production are mildly affected in strains lacking eL22. In this context, we have proved that the synthesis of ribosomes lacking of eL22 is partially blocked in the nucleus. Thus, our results indicate that the presence of eL22 is necessary for the correct processing of the 27S pre-rRNAs. Moreover, we have observed that eL22 performs an important role in the cytoplasm, where its presence is likely needed for the efficient recycling of assembly factors Arx1 and Alb1. With respect to the eL15 ribosomal protein, in this thesis, we have shown that this protein is essential for the production of mature ribosomes and, thus, for the cell survival and cell growth. Specifically, we have demonstrated that eL15 is necessary for the precise processing of the 27SA3 and 27SB pre-rRNAs in the nucleolus. This is due to the role of eL15 in the stabilization of early ribosomal particles which permits the stable assembly of proteins of its own functional cluster (eL8, eL36 y eL13) and association of numerous assembly proteins, known as A3- and B-factors, which are necessary for the processing of the 27SA3 and 27SB pre-rRNAs, respectively.

Los ribosomas son complejos ribonucleoproteicos encargados de la traducción de proteínas. La traducción es un proceso esencial en todos los organismos mediante el cual, la información contenida en el mRNA (RNA mensajero) se descodifica generando proteínas. El proceso de biogénesis ribosómica presenta igualmente una importancia crucial en todas las células. Los ribosomas se componen de dos subunidades diferenciadas, una llamada subunidad grande y otra llamada pequeña, también denominadas 60S y 40S en Saccharomyces cerevisiae, el organismo modelo usado en esta tesis. Como la biogénesis de los ribosomas está muy conservada entre los distintos eucariotas, S. cerevisiae es un organismo perfectamente adecuado para este estudio. Los ribosomas de S. cerevisiae están compuestos por 79 proteínas ribosómicas y 4 RNAs ribosómicos (rRNAs), tres de ellos en la subunidad grande (25S, 5.8S y 5S) y uno en la pequeña (18S). La biogénesis de los ribosomas es un proceso extraordinariamente complejo en el que intervienen los cuatro rRNAs y las 79-80 proteínas ribosómicas, del orden de 100 RNAs pequeños nucleolares (snoRNAs) y más de 300 factores proteicos de ensamblaje, que al no formar parte de las subunidades maduras también son llamados factores de actuación en trans. La síntesis de ribosomas es un proceso secuencial altamente regulado y organizado que empieza en el nucleolo y progresa ordenadamente a través del nucleoplasma; las partículas pre-ribosómicas prácticamente completas son exportadas al citoplasma donde los últimos pasos de maduración tienen lugar antes de ser reclutadas al proceso de traducción. El papel de los distintos componentes que participan en la biogénesis de las subunidades ribosómicas ha sido ampliamente estudiado en las ultimas décadas. Sin embargo, aún quedan numerosos factores de ensamblaje y algunas proteínas ribosómicas por ser caracterizadas en detalle. Este era el caso de las proteínas ribosómicas eL22 y eL15 durante el ensamblaje de la subunidad 60S antes del estudio realizado en esta tesis doctoral. Con respecto a la proteína ribosómica eL22, en esta tesis, hemos demostrado que, aunque en condiciones de laboratorio, esta proteína no es esencial para la supervivencia celular, el crecimiento celular y la síntesis de ribosomas desprovistos de eL22 se encuentran afectados. Así, hemos demostrado que la síntesis de ribosomas carentes de eL22 se encuentra ligeramente bloqueada en el núcleo. Nuestros resultados indican que la presencia de eL22 es necesaria para el correcto procesamiento del pre-rRNA 27S. Además, hemos observado que eL22 juega un papel importante en el citoplasma, donde su presencia es probablemente necesaria para el reciclaje eficaz de los factores de ensamblaje Arx1 y Alb1. Con respecto a la proteína ribosómica eL15, en esta tesis se demuestra que esta proteína es esencial para la producción de ribosomas maduros y, por tanto, para la supervivencia y el crecimiento celular. En concreto, hemos demostrado que eL15 es necesaria para el correcto procesamiento de los pre-rRNAs 27SA3 y 27SB en el nucleolo. Esto a su vez se debe al papel de eL15 en la estabilización de partículas ribosómicas tempranas que permitan la unión estable de diversas proteínas ribosómicas de su propio grupo funcional (eL8, eL36 y eL13) y numerosos factores de ensamblaje, denominados factores A3 y B que son necesarios para el procesamiento de los pre-rRNAs 27SA3 y 27SB, respectivamente.